柱后加堿-高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定 農田土中草銨膦、氨甲基膦酸和草甘膦殘留

陶雪梅, 朱紅霞, 高立紅, 李仁勇

(1. 甘肅省環境監測中心, 甘肅 蘭州 730030; 2. 中國環境監測總站, 北京 100012; 3. 賽默飛世爾科技 (中國)有限公司應用研發中心, 北京 100085; 4. 中科譜研(北京)科技有限公司, 北京 100027)

草甘膦(glyphosate, GLY, C3H8NO5P)和草銨膦(glufosinate, GLUF, C5H15N2O4P)都是常用廣譜除草劑;氨甲基膦酸(aminomethylphosphonic acid, AMPA, CH6NO3P)是草甘膦的主要降解產物。草甘膦屬滅生性除草劑,草銨膦屬觸殺性除草劑。草甘膦因高效、低價、人體代謝快等優勢使用量大、應用廣泛[1],而草銨膦則是以其除草迅速、可去除多年生惡性雜草的優勢,作為新一代除草劑進入市場[2]。隨著這兩種除草劑使用量日益增大,其在土壤中的殘留問題越來越受到關注。目前已有多項研究表明,草甘膦和草銨膦具有毒性作用,對土壤生態環境和人體健康都具有潛在危害[3-11]。Marlise等[12]研究了草甘膦對新生大鼠子宮形態以及細胞分化增殖蛋白表達的影響,認為草甘膦有引起女性生育能力下降并致子宮瘤的可能。

目前測定土壤中草甘膦、氨甲基膦酸和草銨膦殘留量的方法主要有氣相色譜法[13,14]、液相色譜法[15-18]、高效液相色譜-串聯質譜法[19-25]和離子色譜法[26-28]。由于3種目標物的水溶性強且沒有紫外吸收,用氣相色譜和液相色譜檢測都需繁瑣的衍生過程。液相色譜-質譜法則因其公認的操作繁瑣而應用并不普遍。故而離子色譜法有一定的優勢。

現有文獻報道[26-28]中使用離子色譜法測定3種目標物時,使用的檢測器均為電導檢測器,目前暫無離子色譜-安培檢測法同時測定3種農藥的文獻報道。常見陰離子在電導檢測時有響應,基質干擾大,導致目標物檢測的靈敏度低、檢出限高。而在安培檢測器上,常見陰離子無響應,這使該方法在選擇性和靈敏度方面優勢明顯。本研究選用2 mmol/L氫氧化鈉振蕩提取,IC-C18和IC-Na柱固相萃取凈化,采用離子色譜-安培檢測法同時測定農田土中草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸。前處理操作簡單快速,回收率高,定性定量準確,分析速度快,能滿足實際工作的需要。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ICS5000+離子色譜儀,配脈沖安培檢測器(美國Thermo Fisher公司); 0.1 mg和0.01 mg分析天平(瑞士梅特勒公司); Milli-Q超純水儀(成都唐氏康寧科技發展有限公司);小型振蕩器(北京國環高科自動化技術研究院);水系針式過濾器(0.22 μm,杉羽天津科技發展有限公司); IC-C18柱和IC-Na柱(中國Agela公司); 50%氫氧化鈉水溶液(英國AlafAesar公司);氨甲基膦酸(純度≥99.9%)和草甘膦(純度≥98.6%)(德國Dr. Ehrenstorfer公司),草銨膦(上海Aladdin industrial Corporation公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1儀器條件

離子色譜條件:IonPacAS11-HC色譜柱(250 mm×4 mm);流速0.5 mL/min;柱溫35 ℃;進樣量200 μL;淋洗液為100 mmol/L氫氧化鈉和純水,梯度條件見表1;柱后加堿淋洗液及流速為100 mmol/L氫氧化鈉,0.2 mL/min。

表 1 NaOH梯度淋洗程序Table 1 Gradient of NaOH elution procedure

A: H2O; B: 100 mmol/L NaOH.

1.2.2樣品前處理

提取:參照HJ/T 166土壤環境監測技術規范,將土樣風干后過60目篩。稱取2.5 g試樣(精確至0.001 g)于50 mL具塞聚乙烯管中,加入50 mL 2 mmol/L氫氧化鈉溶液,300 r/min下振蕩1 min。

凈化:將提取液依次用0.22 μm水系針式濾器、IC-C18和IC-Na柱凈化,棄去2 mL初流出液后開始收集,待測。

2 結果與討論

2.1 離子色譜柱的選擇

選用實驗室常用的4種陰離子色譜柱,研究它們對3種目標物的分離效果:IonpacAS20(250 mm×2 mm)、IonpacAS23(250 mm×4 mm)、IonpacAS19(250 mm×4 mm)和IonpacAS11-HC(250 mm×4 mm)。結果表明:草銨膦和氨甲基膦酸在IonpacAS20柱上不能完全分離;目標物在IonpacAS23柱和IonpacAS19柱上的響應較低;目標物在IonpacAS11-HC柱上的響應高,且草銨膦和氨甲基膦酸分離較好。故最終選用IonpacAS11-HC色譜柱(250 mm×4 mm)。色譜柱型號不同,填料的粒徑、鍵合功能基和數量、親水性能等均有一定差異,因此會出現有些色譜柱響應低且不能有效分離的現象。

2.2 檢測器的選擇

圖 1 加標土壤樣品的色譜圖(電導檢測器)Fig. 1 Chromatogram of a spiked soil sample(conductivity detector) Spiked levels: GLUF, 1.00 mg/L; AMPA, 1.00 mg/L; GLY, 1.00 mg/L.

2.3 離子色譜條件的優化

IonpacAS11-HC色譜柱(250 mm×4 mm)在流速為1.0 mL/min時柱效最高。但如圖2所示,在此流速下,草銨膦和氨甲基膦酸的色譜峰分離度R<1.5;在0.5 mL/min的流速條件下,草銨膦和氨甲基膦酸可以有效分離。故選用0.5 mL/min的淋洗液流速。

圖 2 淋洗液流速對加標土壤樣品分離的影響Fig. 2 Effect of the eluent flow rate on the separation of the spiked soil sample Spiked levels: 0.10 mg/L.

草銨膦和氨甲基膦酸在IonpacAS11-HC上的保留較弱,而草甘膦在IonpacAS11-HC上的保留較強。且在一定濃度范圍內,隨著淋洗液的濃度升高,3種目標物的峰面積變大。但當淋洗液濃度大于30 mmol/L時,草銨膦和氨甲基膦酸不能完全分離。為解決該問題,選用梯度淋洗和柱后加堿的方法[29-31],在色譜柱后、檢測器前增加一路低流速、高濃度的淋洗液,提高目標物測定的靈敏度。如圖3所示,柱后加堿可使草甘膦的檢查靈敏度明顯提高。

圖 3 柱后加堿對標準溶液分離的影響Fig. 3 Effect of the post-column addition of alkali on the separation of the standard solution Mass concentrations: 0.50 mg/L.

按照優化的色譜條件(見1.2.1節),所得加標實際樣品的色譜圖見圖4。

2.4 提取劑的選擇

應用離子色譜法測定3種目標物時,常用的提取液為純水和堿溶液[19-21]。提取液濃度對不同目標物提取效率的影響程度不同。如圖5所示,隨著氫氧化鈉濃度的升高,草銨膦和草甘膦的加標回收率逐漸降低;而氨甲基膦酸的加標回收率逐漸升高,在10 mmol/L時達到最大回收率102.4%。為實現3種目標物同時測定,且盡量少引入干擾,最終選用2 mmol/L氫氧化鈉作為提取劑。

圖 4 加標土壤樣品的色譜圖(安培檢測器)Fig. 4 Chromatogram of a spiked soil sample(amperometric detector)Spiked levels: GLUF, 1.00 mg/L; AMPA, 0.20 mg/L; GLY, 1.00 mg/L.

圖 5 氫氧化鈉提取液濃度對加標回收率的影響Fig. 5 Effect of the concentration of sodium hydroxide on the spiked recovery

圖 6 超聲提取和振蕩提取對目標物測定的影響Fig. 6 Effect of the ultrasonic extraction and the shaking extraction on the determination of the targets

2.5 提取方式的選擇

對比超聲提取和機械振蕩提取兩種提取方式,結果如圖6所示。超聲提取后,提取液中雜質峰較大,影響目標物(尤其是草銨膦)的測定。原因可能是,超聲提取時,樣品溫度升高,干擾物的提取量增加,而干擾物的保留時間與草銨膦接近,影響了定量。振蕩提取時,3種目標物的加標回收率滿足要求。

2.6 老化時間的影響

測定土壤樣品的加標回收率,不可避免地要討論標準溶液滴入土壤中的老化時間,以保證加標樣在實際土壤上的吸附平衡。在2.5 g土壤樣上滴加50 μL 250 mg/L的混合標準溶液,放置不同時間后測定,結果如圖7所示。可見放置時間對氨甲基膦酸的影響不大;而草銨膦和草甘膦的加標回收率在放置5 h后低于70%,且在5 h時滴入的50 μL標準溶液已干。因此,為保證加標回收率滿足要求且標準溶液在土壤中吸附平衡,滴加并放置5 h后進行樣品提取。

圖 7 老化時間對加標回收率的影響Fig. 7 Effect of the aging time on the spiked recovery

圖 8 振蕩時間對加標回收率的影響Fig. 8 Effect of the oscillation time on the spiked recovery

2.7 振蕩時間的選擇

在300 r/min的條件下,在1～15 min內記錄目標物的加標回收率,結果如圖8所示。3種目標物的加標回收率在不同振蕩時間下變化不大。為提高萃取效率,且考慮方法的普適性,最終選取振蕩時間為5 min。

2.8 提取劑體積的選擇

通過改變提取劑和土壤質量比的方式選擇最佳的提取液體積。如圖9所示,除5∶1和50∶1時有回收率低于80%的現象外,其他情況下的回收率均在80%～102%之間。為防止樣品過度稀釋造成靈敏度降低,同時也為滿足樣品的測定體積,最終選擇提取液和土壤樣品質量比為20∶1,即1 g土壤用20 mL 2 mmol/L NaOH振蕩提取。

圖 9 提取劑和土壤的質量比對加標回收率的影響Fig. 9 Effect of the mass ratio of the extractant and the soil sample on the spiked recovery

2.9 凈化條件的優化

土壤中含有大量可溶于水的有機物和無機物。由于進樣量較大,大量樣品測試時會降低色譜柱的使用壽命。為了去除提取液中的干擾雜質,選用IC 柱凈化,其中IC-C18柱去除樣品基質中的疏水性物質,IC-Na柱去除提取液中的重金屬。為保證處理過程對目標物的測定不產生影響,標準溶液先用不同IC柱凈化,所得色譜圖如圖10。目標物的色譜峰重疊性較好,可見IC柱對目標物的測定影響不大,可以用于提取液的凈化。

圖 10 加標樣品經不同IC柱凈化后的色譜圖Fig. 10 Chromatograms of the spiked sample purified by different IC columns Spiked levels: GLUF, 0.25 mg/L; AMPA, 0.05 mg/L; GLY, 0.25 mg/L.

2.10 檢出限和線性方程

按照HJ 168-2010中的檢出限計算公式,對低濃度的目標物混合標準溶液平行測定7次,結果見表2。草銨膦、氨甲基膦酸和草甘膦的方法檢出限分別為0.08、0.02和0.04 mg/kg,滿足土壤環境質量標準(GB 15618-2008征求意見稿)中土壤有機物的第二級標準對草甘膦(0.5 mg/kg)的限值要求。

表 2 草銨膦、氨甲基膦酸和草甘膦的方法檢出限(n=7)Table 2 LODs of GLUF, AMPA, and GLY (n=7)

表 3 GLUF、AMPA和GLY的回歸方程和相關系數Table 3 Regression equations and correlation coefficients (r2) for GLUF, AMPA and GLY

y: peak area;x: mass concentration of the analyte, mg/L.

用優化后的測定條件對3種目標物的系列混合標準溶液進行分析,其中草銨膦和草甘膦的線性范圍是20.0～1 000 μg/L,氨甲基膦酸的線性范圍是5.0～400 μg/L。以目標物質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制校準曲線,得出回歸方程和線性相關系數(r2),具體如表3所示。

2.11 實際樣品測試

采集北京某地農田土,按照優化后的測定條件對樣品中的3種目標物進行測定。3種目標物中只有氨甲基膦酸有檢出,說明該農田噴灑過除草劑草甘膦,且已經降解成氨甲基膦酸。平行測定6次的相對標準偏差為0.7%～5.0%,加標回收率為80.2%～106%(見表4)。

表 4 3種目標物在農田土中3個水平下的加標回收率(n=6)Table 4 Recoveries of the three targets at three spiked levels in farmland soil (n=6)

ND: not detected.

3 結論

本文建立了一種簡單、快捷、同時測定農田土中草銨膦、氨甲基膦酸和草甘膦殘留量的高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測方法。樣品采用2 mmol/L氫氧化鈉溶液提取和IC-C18和IC-Na柱快速凈化的方法進行樣品前處理,IonpacAS11-HC離子色譜柱分離,安培檢測器檢測。實際樣品分析表明本方法抗干擾性強,靈敏度和準確度高,操作簡便快捷,適用于農田土壤中草銨膦、氨甲基膦酸和草甘膦殘留的同時快速定量分析。