化妝品及香精中27種香料的氣相色譜-質譜檢測方法

劉思然, 朱 英

(中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所, 北京 100021)

香料作為化妝品的重要組成部分具有改變產品氣味、使其散發獨特芬芳的作用。然而伴隨不斷的發展與應用,香料帶來的安全性問題也愈發凸顯。最常見的為香料過敏,占到全部化妝品過敏案例的三分之一以上[1],在標準系列抗原斑貼試驗中,芳香混合物、松香等物質陽性率通常處于較高水平[2],香料過敏臨床表現則多為變應性接觸性皮炎。除過敏外,香料使用不當還可導致中毒等其他不良影響。

本文選擇歐盟化妝品法規(EC1223-2009-EU Cosmetics Regulation-in Force)[3]規定含量超過一定水平時需在化妝品標簽上予以標注的24種易致敏合成香料以及我國《化妝品安全技術規范》(2015年版)[4]和歐盟化妝品法規有明確使用限制的6-甲基香豆素、麝香二甲苯和酮麝香3種香料(6-甲基香豆素可用于口腔衛生用品但禁用于化妝品;麝香二甲苯和酮麝香為化妝品限用組分),共計27種香料,建立同時測定化妝品及香精中上述香料的檢測方法,并對市售29份香精及40份外包裝標識含有香料的化妝品進行測定,為了解國內化妝品與香精市場香料使用情況提供數據支持,為進一步強化致敏香料的規范使用提供客觀依據。

對于歐盟化妝品法規規定的24種香料,常見的檢測方法包括氣相色譜法[5-7]和液相色譜法[8,9],所測定的香料種類有1種或多種,國際日用香料香精協會(以下簡稱IFRA)曾發布上述24種香料的氣相色譜-質譜檢測方法[5],但缺少必要的前處理步驟及色譜柱的選擇原則、方法特性指標等詳細信息,缺乏可重復性。王玉健等[8]曾建立香水中類過敏原香料的液相色譜質譜檢測方法,但前處理方法與檢測樣品僅限于香水。對于其余3種香料,檢測6-甲基香豆素多用液相色譜法[10],檢測麝香二甲苯、酮麝香等麝香類物質多采用氣相色譜法[11-13]。本文在IFRA發布的檢測方法的基礎上,細化樣品前處理步驟、優化色譜條件,并增加我國重點關注的禁限用組分。目前尚未見到同時測定化妝品及香精中27種香料的相關報道。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀,電子轟擊離子(EI)源(美國安捷倫公司), T-214萬分之一分析天平(美國丹佛公司), Vortex Genie 2多用途渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)。

27種香料標準品:戊基肉桂醛(amyl cinnamal)、丁香酚(eugenol)、羥異己基3-環己烯基甲醛(hydroxyisohexyl-3-cyclohexene carboxaldehyde)、茴香醇(anise alcohol)、金合歡醇(farnesol)(美國AccuStandard公司),水楊酸芐酯(benzyl salicylate)(德國Fluka公司), 6-甲基香豆素(6-methylcoumarin)(中國百靈威公司),苯甲醇(benzyl alcohol)、肉桂醇(cinnamyl alcohol)、檸檬醛(citral)、羥基香茅醛(hydroxycitronellal)、異丁香酚(isoeugenol)、戊基肉桂醇(amyl cinnamyl alcohol)、肉桂醛(cinnamal)、香豆素(coumarin)、香葉醇(geraniol)、肉桂酸芐酯(benzyl innamate)、丁苯基甲基丙醛(butylphenyl methylpropional)、芳樟醇(linalool)、苯甲酸芐酯(benzyl benzoate)、香茅醇(citronellol)、己基肉桂醛(hexyl cinnamal)、苧烯(limonene)、2-辛炔酸甲酯(mehtyl 2-octynoate)、α-異甲基紫羅蘭酮(alpha-isomethylionone)、麝香二甲苯(musk xylene)、酮麝香(musk ketone)(德國Dr. Ehrenstorfer公司)。各香料標準品純度從72.1%～99.7%不等,麝香二甲苯標準品為100 mg/L環己烷溶液,其余標準品溶液配制時根據實際純度換算后稱取。甲醇(色譜純,德國Merck公司);超純水(18.2 MΩ·cm,朗泰純水機)。

1.2 標準溶液配制

準確稱取適量香料標準品(麝香二甲苯除外)溶于甲醇,分別配制成質量濃度為4 g/L的標準儲備溶液。臨用時移取儲備溶液及麝香二甲苯標準溶液適量,配制成各組分質量濃度為100 mg/L(麝香二甲苯質量濃度為8.00 mg/L)的混合標準溶液。取混合標準溶液,用甲醇稀釋成各組分質量濃度為1.00、5.00、10.0、25.0和50.0 mg/L的混合標準系列溶液(麝香二甲苯質量濃度為0.080、0.400、0.800、2.00和4.00 mg/L)。

1.3 樣品前處理

1.3.1香精

稱取0.1 g(精確到0.000 1 g)樣品于具塞比色管中,用甲醇定容至25 mL,充分振蕩均勻,若濃度過高可適當稀釋,經0.45 μm有機相濾膜過濾,進樣分析。

1.3.2化妝品

液體類化妝品(含香水):稱取0.2 g(精確到0.000 1 g)樣品于具塞比色管中,用甲醇定容至10 mL,充分振蕩均勻,若濃度過高可適當稀釋,經0.45 μm有機相濾膜過濾,進樣分析。

乳液、霜、膏等其余類別化妝品:稱取0.5～1.0 g(精確到0.000 1 g)樣品于具塞比色管中,加入0.5 mL飽和氯化鈉溶液,用甲醇定容至10 mL,充分振蕩均勻,必要時超聲,取上清液經0.45 μm有機相濾膜過濾,進樣分析。

1.4 色譜條件

色譜柱:HP-5MS弱極性毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);載氣:氦氣;載氣總流量:24 mL/min;分流比:1∶20;分流流量:20 mL/min;進樣量:1 μL;進樣口溫度:250 ℃;升溫程序:80 ℃保持5 min后,以10 ℃/min升至250 ℃,保持5 min;運行時間:27 min。

1.5 質譜條件

離子化方式:EI離子源;掃描范圍:30～500 amu;采集模式:全掃描;定量模式:選擇離子定量;碰撞能量:70 eV;溶劑延遲:3.00 min; MS離子源溫度:230 ℃; MS四極桿溫度:150 ℃。各化合物分析條件見表1。

表 1 27種香料的保留時間與特征離子Table 1 Retention time and characteristic ions for the 27 fragrances

*Quantifier ions. Citral has two peaks at 9.750 and 10.250 min, respectively.

2 結果與討論

2.1 條件優化

2.1.1標準溶液保存條件

因香料揮發性較強,標準溶液保存條件選擇不當則會影響其穩定性。本文探索常溫(NPT)、4 ℃冷藏、-20 ℃冷凍3種保存方式對其穩定性的影響,以確定標準儲備溶液的保存方式。考慮到工作量,取混合標準系列溶液中濃度最高的一組溶液密封于樣品瓶中,上述保存方式各放置5瓶,分別于放置第1、3、4、5和6天各取1瓶上機檢測其穩定性。

測定結果表明,不同香料的穩定性差異較大,且與保存時間、保存方式密切相關。多數香料在放置3～4天時濃度基本穩定或略有上升,隨后逐漸下降,到第6天時下降明顯。究其原因,可能是放置的最初幾天,甲醇和香料的揮發均不明顯或甲醇的揮發略快于香料,導致香料表現出輕微的濃縮效果;隨后幾天,香料的揮發速度明顯快于甲醇,導致香料濃度逐漸下降。其中,冷藏保存的標準溶液,整體變化趨勢較其他2種條件更加平穩。

在測試期內,以變化率≤10%的最多天數確定保存時間,天數相同時以變化趨勢最緩確定保存方式,并將結果外推至濃度更高的標準儲備溶液,混合標準系列溶液則建議現用現配。27種香料標準儲備溶液的推薦保存條件見表2。

2.1.2樣品前處理方法

鑒于27種香料在甲醇中的溶解度均很好,香精及香水等液體類化妝品直接用甲醇分散并振蕩均勻即可。乳霜等其他類別化妝品,只用甲醇不易分散,提取效果不佳,因此考察了破乳、振蕩、超聲等操作對提取效果的影響。

選取一份加入甲醇后振蕩即可分散均勻的樣品及一份在振蕩情況下不能分散均勻的樣品進行對比,各提取條件下樣品分散情況及以芳樟醇、香茅醇、香葉醇含量為例的檢測結果見表3。

結果表明,加入0.5 mL氯化鈉飽和溶液有很好的破乳作用,提取效果明顯改善;振蕩有利于分散樣品,也能提高提取效果;超聲萃取雖然能夠改善樣品的分散效果,但也可能會加快香葉醇等部分香料的揮發,導致提取效率反而下降。綜合考慮,前處理方法的選擇原則是,首先盡量簡化操作,減少香料揮發;其次,對于能夠通過加入氯化鈉飽和溶液破乳、振蕩分散的樣品,不建議使用超聲提取方式,只在必要時慎重使用超聲提取。

表 2 27種香料儲備液的推薦保存條件Table 2 Recommended save conditions for the standard stock solution of the 27 fragrances

NPT: normal pressure and temperature.

2.1.3色譜柱的選擇

考慮到27種合成香料都具有一定極性,本研究比較了強極性(HP-INNOWax, 30 m×0.25 mm×0.25 μm)、中極性(DB-225MS, 30 m×0.25 mm×0.25 μm)與弱極性(DB-5MS, 30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱中各組分的分離情況。強極性色譜柱因熱穩定性不強,在升溫到一定程度時,基線易漂移,影響檢測結果,只同時檢出13種物質,且檢出限較高。中極性色譜柱有5種物質無法檢出,包括羥基香茅醛、肉桂酸芐酯、金合歡醇、麝香二甲苯和酮麝香,在溫度升高至150 ℃附近時,基線漂移,且漂移對化合物檢出限的影響隨溫度上升而加劇。弱極性色譜柱能夠同時檢測出全部27種香料,分離度理想(詳見圖1)。綜合考慮化合物的檢出限、分離度與總運行時間,選擇弱極性色譜柱進行檢測。

圖 1 弱極性色譜柱檢測27種香料總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatograms for the 27 fragrances using a weak polar column The mass concentration of musk xylene is 2.00 mg/L, and the mass concentrations of the others are 25.0 mg/L. Peak Nos.: 1. limonene; 2. benzyl alcohol; 3. linalool; 4. mehtyl 2-octynoate; 5. citronellol; 6. citral-1; 7. geraniol; 8. citral-2; 9. cinnamal; 10. anise alcohol; 11. cinnamyl alcohol; 12. eugenol; 13. coumarin; 14. hydroxycitronellal; 15. isoeugenol; 16. alpha-isomethylionone; 17. butylphenyl methylpropional; 18. 6-methylcoumarin; 19. amyl cinnamal; 20. hydroxyisohexyl-3-cyclohexene carboxaldehyde; 21. amyl cinnamyl alcohol; 22. farnesol; 23. hexyl cinnamal; 24. benzyl benzoate; 25. musk xylene; 26. benzyl salicylate; 27. musk ketone; 28. benzyl innamate.

2.2 方法特性

2.2.1線性范圍和檢出限

以化合物的質量濃度(mg/L)對相應的峰面積做外標標準曲線。羥異己基3-環己烯基甲醛、羥基香茅醛及麝香二甲苯分別在5～50、5～50和0.4～4 mg/L,其余24種香料在1～50 mg/L范圍內線性關系良好,相關系數均大于等于0.996。以3倍信噪比計算檢出限,10倍信噪比計算定量限,并以稱取1 g樣品稀釋至10 mL計,羥異己基3-環己烯基甲醛、羥基香茅醛及麝香二甲苯的定量限分別為50、50和4 mg/kg,其余24種香料定量限為10 mg/kg,詳見表4。

表 4 27種香料的線性范圍、回歸方程、相關系數(r)、檢出限和定量限Table 4 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), LODs and LOQs of the 27 fragrances

表 4 (續)Table 4 (Continued)

x: peak area;y: mass concentration, mg/L. The two citral peaks, at 9.750 and 10.250 min, are combined in the quantification.

表 5 空白樣品加標回收率和精密度(n=6)Table 5 Spiked recoveries and precisions of the blank samples (n=6)

The two citral peaks, at 9.750 and 10.250 min, are combined in the quantification.

對于歐盟化妝品法規規定的24種香料,因具有較寬的極性范圍,因此對于此類物質的檢測方法中同時檢測物質通常為十余種。若為滿足更多香料的同時檢測需求,通常在靈敏度上會有所犧牲,采用色譜-質譜法檢測的檢出限通常為2～20 mg/kg[6,8,9]。本方法對麝香二甲苯、羥基香茅醛和羥異己基3-環己烯基甲醛的檢出限分別為1.2、15和15 mg/kg,其余香料檢出限為3.0 mg/kg,經實際樣品測試,能夠滿足其對香料成分的定性定量分析。為滿足27種香料成分同時檢測的需求,本方法犧牲了部分靈敏度,對于靈敏度要求較高的樣品,可嘗試進一步優化羥基香茅醛與羥異己基3-環己烯基甲醛的色譜-質譜條件或更換更適宜的檢測方法,以獲取更低的檢出限和更高的靈敏度。

2.2.2加標回收率

在化妝品空白基質中添加1.2節中的混合標準溶液,至香料終質量濃度分別為5.00、25.0和50.0 mg/L(麝香二甲苯為0.400、2.00和4.00 mg/L),采用本法進行樣品前處理與氣相色譜-質譜分析,各水平檢測2份平行樣品。回收率檢測結果見表5,除麝香二甲苯外均在81.5%～118%之間。麝香二甲苯回收率較低,為73.3%～76.1%。可能由于香料標準品本身揮發性較強,且實驗過程中加標濃度較低,經過一系列前處理后造成待測組分損失,導致實際加標量低于添加理論值。

2.2.3精密度

對27種香料各選擇低、中、高3種質量濃度(質量濃度同2.2.2節)進行加標,平行測定6份,計算精密度,結果見表5。27種香料的相對標準偏差皆小于10%(1.70%～9.71%之間),滿足檢測需求。

表 6 27種香料的檢出量及檢出率結果Table 6 Results of the detected contents and detection rates for the 27 fragrances

ND: not detected.

2.3 實際樣品檢測

選取69份樣品進行檢測(其中香精29份、香水19份、其他類別外包裝標識含有香料的化妝品21份),均檢出含有除6-甲基香豆素外的26種香料中的1種或多種,檢出香料的含量范圍在0.001%～32.2%之間,具體結果見表6。

香精樣品中香料的使用水平相對較高,檢出香料的含量范圍在0.001%～32.2%之間,使用率較高的依次是苧烯、芳樟醇和水楊酸芐酯,未檢出6-甲基香豆素。有2份樣品檢出麝香二甲苯,購買時廠家明確建議,應適當稀釋,使其在化妝品中的添加量符合《化妝品安全技術規范》(2015年版)[4]的規定。為避免由于香料使用方法不當導致的安全隱患,廠商應在消費者購買時做出正確的使用引導。

香水樣品中檢出香料的含量范圍在0.008%～3.28%之間,使用率較高的依次是水楊酸芐酯、苧烯和檸檬醛,未檢出6-甲基香豆素和麝香二甲苯。其他外包裝標識含有香料的化妝品中香料的使用水平最低,添加率與濃度水平遠遠低于香精與香水,含量范圍在0.002%～0.980%之間,檢出率較高的依次是水楊酸芐酯、芳樟醇、苯甲醇和香茅醇,未檢出丁香酚、6-甲基香豆素、戊基肉桂醇和麝香二甲苯4種香料。香水與其他類別化妝品中,共有3份樣品檢出酮麝香,濃度均低于《化妝品安全技術規范》(2015年版)[4]的限制要求,符合規定,可以放心使用。

測定結果表明,香精、香水和其他類別化妝品中香料的使用種類和使用量依次降低,使用習慣則基本一致。在3類樣品中添加率較高的香料為水楊酸芐酯、苧烯、芳樟醇等,而添加率最低的則是麝香二甲苯、酮麝香、茴香醇和肉桂醛(6-甲基香豆素除外),這與筆者所進行的化妝品中致敏原香料標注情況調查結果基本一致[14]。此外,69份樣品中除1份樣品使用1種香料外,其余樣品均復配使用多種香料,以達到預期效果。

3 結論

本文通過對標準溶液保存條件、前處理方法、色譜柱等相關條件進行探索、優化,建立了27種香料的氣相色譜-質譜聯用檢測方法,在方法特性上基本滿足檢測需求。與IFRA發布的檢測方法相比,該方法明確了樣品前處理步驟,優化了色譜條件,增加了方法特性指標信息,并增加了我國重點關注的禁限用組分。利用所建立方法,對29份香精及40份外包裝標識含有香料的化妝品進行測定,實際樣品檢測結果與香料標注情況調查結果基本一致,為了解國內化妝品與香精市場香料使用情況提供數據支持。

本研究在以下幾方面還有待完善:對于羥異己基3-環己烯基甲醛和羥基香茅兩種香料,為了滿足同時檢測的需求,犧牲了靈敏度,對于靈敏度要求較高的樣品,可嘗試進一步優化色譜-質譜條件或更換更適宜的檢測方法,以獲取更低的檢出限和更高的靈敏度。對于麝香二甲苯,可更換濃度較高的標準品以增加標準系列溶液中的實際濃度,減少前處理過程中待測組分的損失。