微流控芯片技術在生殖研究中的進展

石 楊, 邵小光

(大連市婦女兒童醫療中心, 生殖與遺傳研究醫學中心, 遼寧 大連 116037)

生殖是生物體的最基本特征之一,是物種得以延續和進化的保證。聯合國特別規劃署曾在20世紀末提出,21世紀將成為人類“生殖健康”世紀,并向全世界人民發出增加對生殖健康問題關注度的號召。我國作為世界上最大的人口大國,近年來也在逐步增強對生殖問題研究的投入,特別是在基礎研究領域。我國育齡人口不孕不育率已高達15%～20%，不孕夫婦約2 000萬[1],而且不能生育的夫妻呈年輕化趨勢,就診年齡最小23歲,最大40歲。目前,不孕不育和出生缺陷是生殖領域的重大問題。

微流控技術是20世紀90年代初期隨電子和光刻等高技術的發展而誕生的。隨著微加工、微電子技術的發展,微流控芯片系統也得到了迅猛發展,技術也逐漸成熟,目前已經由微流控芯片制作的操控階段向追求合理應用和廣大市場需求的生產化階段轉變,其應用領域包括化學、生物學、物理學、醫學等,其研究對象包括小分子、蛋白質、核酸、細胞、組織、器官和模式生物等,顯示出了強大的發展前景和應用潛力[2-6]。在生殖生育研究中,微流控研究剛剛起步,微流控技術具有以下優勢:微管道的形狀和尺寸可以靈活設計,從而更好地模擬生理環境;微流控芯片對樣品的消耗量低,可減少樣品需求量,適用于臨床樣本研究;微流控技術可以集成多個實驗步驟，具有很高的集成性。

綜上,微流控技術已被應用到精子活力評價與篩選、精子的化學趨向性篩選、卵丘細胞去除、透明帶移除、卵細胞定位與篩選、受精過程、早期胚胎培養以及生殖器官模擬等各個方面[7]。

1 微流控技術與精子篩選

1.1 微流控技術與精子活力評價

利用微流控裝置對精子活力進行篩選和評價的方法包括:微管道篩選、介電電泳力篩選以及層流效應篩選。Kricka等[8]制作的以硅和玻璃為材料的微管道芯片,用于人精子計數及活力測定,開創了在微流控芯片上進行精子活力的評價技術。1997年,Kricka等[9]對其所設計的芯片進行了改進,利用彎曲的通道芯片評價精子活力,通過微管道得到的結果與馬克勒室檢測得到的結果進行對比,發現兩種方法所得的精子活力分級結果具有良好的相關性。Fuhr等[10]利用高頻電場對人的單個精子實現了捕獲、定位和篩選。Schuster等[11]利用層流效應篩選活力精子,經過篩選精子活力由44%±4.5%提高到98%±0.4%(p<0.05),精子的正常形態率由10%±1.05%提高到22%±3.3%(p<0.05);然而這項技術的缺陷在于精子的回收率不高(目前進樣口僅能進樣40～50 μL液體,而30 min內只能回收10～20 μL精液)。微流控精子分析可與計算機輔助精子分析(CASA)方法結合對斑馬魚精子進行準確和快速的分析,能夠快速激活精子并持續測量其運動能力,將有助于提高精子研究的重現性,并有助于精子庫的開發[12],說明微流控分析技術可與其他分析技術結合發揮更高的效能。

1.2 微流控技術精子趨化性評價

Koyama等[13]采用聚二甲基硅氧烷-玻璃復合結構的微流控芯片評價了小鼠精子在卵巢提取液中的趨化作用。該芯片具有3個對稱的進樣通道和3個對稱的出樣通道,在一側進樣管道通入卵巢提取液,另一側通入空白緩沖液,中間管道通入小鼠精液,在中間匯合處可形成化學梯度,實驗結果表明具有化學趨向性的精子約占精子總數的7%左右。

1.3 微流控技術精子趨溫性評價

2003年,Bahat等[14]證明了哺乳動物精子趨溫性的存在。Li等[15]利用不等溫的微流控芯片儲液池,通過研究不同溫度范圍(34.0～35.3 ℃、35.0～36.3 ℃、36.0～37.3 ℃和37.0～38.3 ℃)內的精子反應,發現只有5.7%～10.6%的精子顯示出了熱反應。

2 微流控技術用于卵細胞研究

2.1 微流控技術健康卵細胞篩選

臨床上對健康卵母細胞的篩選主要依靠形態學上的判斷,標準是透明帶完整、卵細胞飽滿、細胞質透明,這樣的方法對人的依賴度較高。為了避免人為影響,Choi等[16]利用正向介電泳,應用卵細胞膜的特性對卵細胞進行篩選,證實移動的卵細胞比不移動的卵細胞具有更好的發育潛能,具有高囊胚形成率(23.8% vs 10.7%,p<0.05)和低多精入卵現象(31.1% vs 42.9%,p<0.05)。這項技術可能為未來自動化挑選卵細胞、提高準備率,克服人為誤差提供理論參考。

2.2 微流控技術顆粒細胞去除

卵丘細胞是聚集在卵細胞周圍的顆粒細胞,與卵細胞共同組成了卵丘-卵母細胞復合體(COC)。在進行卵胞漿內單精子注射(ICSI)等操作時,需要去除卵丘細胞獲得裸卵,以利于精子穿刺入卵。傳統去除卵丘細胞的方法包括物理去除法和化學去除法。物理去除法又包括吹吸法和渦旋振蕩法,即通過用吸管反復吹打卵丘細胞或使用渦旋振蕩器產生機械力,使卵丘細胞脫落;而化學去除法是將COC放置在透明質酸酶溶液中消化而使卵丘細胞從卵細胞周圍解離出來。微流控芯片可以結合上述兩種方法,在流體中實現卵丘細胞的去除。Zeringue等[17]利用兩條呈90°、寬度小于卵細胞直徑的細微通道去除卵丘細胞,當COC進樣到主管道后,在小管道施加負壓,卵丘細胞就會被逐漸吸走,而卵細胞保留在主管道中。這種方法和傳統的渦旋振蕩法相比,具有更高的效率和更小的傷害。

2.3 微流控技術卵細胞的體外成熟

與傳統的靜態培養方法相比,施加微流體更有利于卵細胞的成熟,可能原因是構建的微環境與生理環境更為接近。因此,Waiters等[18]以聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料制作了微流控裝置,用來培養豬卵母細胞。研究發現,常規方法的樣品用量需500 μL,微流控通道方法的樣品用量僅需8 μL,但結果沒有顯著性差異,兩種方法卵母細胞的成熟率分別為51%和61%。隨后,Hester等[19]報道了在PDMS和硼硅酸鹽雜合材料的微管道中培養成熟豬卵母細胞用于體外受精,結果表明,卵裂至2-細胞期的百分率(67%)與對照組(49%)相比顯著升高。Zhao等[20]報道了一種新型的夾層結構微流體芯片用于表征卵母細胞膜傳輸特性,可以進行溶液置換,對溫度具有良好控制能力,可以準確表征卵母細胞膜的溫度依賴性和滲透性。

3 微流控技術體外受精

1995年,美國賓夕法尼亞大學的Kricka等[21]首次在微流控芯片上實現了體外受精。他應用微加工方法在玻璃基底上刻蝕引導精子的管道、卵細胞受精池和精子進樣池。彎曲管道對精子具有篩選作用,只有活力較強并且可以靈活轉彎的精子才能穿越管道,最終到達卵細胞,實現了小鼠的體外受精。然而由于精子進樣量少,受精率比常規體外受精(IVF)方法略低(48%,常規方法65%～80%)。Suh等[22]用比傳統方法更少的精液實現了微流控技術的體外受精,當精液含量降低至2×104～8×104個/mL時,受精率提高,以此說明微流控技術在體外受精研究中的優越性。Cheng等[23]利用4×4的微流控陣列裝置整合了包括卵母細胞的定位、精子篩選、受精和胚胎培養等試管授精所有步驟,結果表明通過篩選通道,小鼠的精子活性從60.8提高到96.1。Ferraz等[24]利用3D打印技術將極化和分化的牛輸卵管上皮細胞制成管狀模擬輸卵管,適用于活體成像并支持體外受精。

4 微流控技術用于胚胎操作

4.1 微流控技術透明帶移除

透明帶去除對于嵌合體產生或轉基因動物制備具有重要的意義,目前常規的做法是采用化學移除法,將受精卵放入酸性裂解液中,直至看到透明帶開始降解,立即將受精卵取出放入培養基完成透明帶去除。Zeringue等[25]設計了一種用以去除透明帶的微流控芯片,用兩個交叉的微管道形成一個“T”形結構,將受精卵限制在主管道的狹窄區域,然后在橫斷的管道中通入裂解液,通過微小的負壓將一小部分裂解液吸入主管道,不斷沖洗胚胎，將透明帶移除干凈,V形的狹窄區可將裸露的胚胎引導在一起,有利于產生嵌合體。

4.2 微流控技術早期胚胎培養

常規的體外培養方式通常在微升到毫升的體積內單個或成組培養胚胎,這和體內的環境不同(輸卵管液常為數微升或更少),而微管道的優勢在于每個胚胎的需要量小于1 μL[26]。有研究[27]證實,在小體積里成組培養胚胎可能更有利于胚胎發育并使總細胞數增多,這是因為胚胎產生的旁分泌和自分泌產物能夠對自身和周圍胚胎起到刺激作用,促進胚胎的自身發育。但是在小體積內同時培養過多胚胎也不利于胚胎發育,原因是在培養過程中代謝產生的有害產物會對胚胎發育產生不良影響。有研究[28]表明,每個胚胎對應0.5～2 μL培養液是較為合適的比例。Raty等[29]研究了不同的管道材料(硅、PDMS和硼硅酸鹽)對胚胎培養的影響,通過和傳統培養皿IVF組比較,發現硅-硼硅酸鹽管道以及PDMS-硼硅酸鹽管道均能更快地發生卵裂并產生更多囊胚,囊胚退化率更低,顯示了微管道在胚胎培養方面的優越性。胚胎培養中另一個重要問題是靜態培養和動態培養孰優孰劣。在生理環境下,由于輸卵管的不斷收縮,胚胎在發育過程中應該是動態的過程,而采用傳統的微滴培養法,胚胎一直處于靜止的狀態。

利用微流體可以使胚胎處于持續流動的流體環境中。Hickman等[30]比較了不同微流體環境下小鼠胚胎的發育狀況。結果顯示,流速為0.1 mL/h時微管道中桑椹胚、囊胚形成率與對照組類似,而當施以連續流體時,桑椹胚、囊胚形成率反而下降。Huang等[31]發明了一種更接近發育中胚胎所在的體內微環境的裝置,開發了一種數字化的微流體裝置。該微流控電潤濕設備被用來模擬胚胎發育過程中體內的流體流動,與傳統的靜態培養相比,小鼠胚胎卵裂的發生率明顯高于傳統的靜態培養模式。目前對于動態培養的研究尚無統一明確的結論。

圖 1 睪丸組織培養微流控芯片的示意圖[34]Fig. 1 Schematic diagrams of the microfluidic chip used to culture testicular tissue[34]

5 微流控芯片技術用于生殖微環境與器官構建

人體芯片,就目前的研究水平而言,更確切地說是芯片仿真人體器官系統(organ-on-a-chip systems),也稱為器官芯片(organs-on-chips)[32],是一種利用微加工技術,在微流控芯片上制造出能夠模擬人類器官主要功能的仿生系統[33]。經過近幾年來的快速發展,研究人員已經在微流控芯片上實現了眾多人體器官的構建,如芯片肝、芯片肺、芯片腸、芯片腎、芯片血管、芯片心臟以及多器官芯片等。然而在生殖器官與微環境中,器官芯片的研究才剛剛起步,目前生殖系統的微流控技術體外構建分為男性生殖微系統和女性生殖微系統。

5.1 男性生殖微系統構建

Komeya等[34]在2016年報道了利用PDMS夾多孔膜芯片,體外模擬鼠睪丸組織,裝入的老鼠睪丸組織碎片成功地維持了精子形成和睪丸激素的分泌。如圖1所示,裝置中培養的睪丸組織成功地維持了6個月的精子形成,產生的精子可以通過微授精產生健康的后代。此外,通過促黃體激素刺激睪丸組織可以持續產生睪酮。

5.2 女性生殖微系統構建

5.2.1胎盤組織

Blundell等[35]利用半透膜隔開的芯片共培養了人的滋養細胞BeWo和絨毛內皮細胞(見圖2a)。培養的滋養層在動態流動條件下形成致密微絨毛,并表達了葡萄糖轉運蛋白,即生理膜轉運蛋白,模擬了葡萄糖的生理轉運過程。另一研究組[36]實現人滋養細胞株JEG-3和人臍靜脈內皮細胞的共培養,該項工作研究了葡萄糖的轉運功能(見圖2b)。體外微流控胎盤模型可以為研究復雜胎盤組織的微環境提供新的方法,并為開發以安全測試孕前的藥物篩選、細菌感染和毒性作用提供有效平臺[37-39]。

圖 2 微流控芯片構建胎盤組織的示意圖Fig. 2 Schematic diagrams of the microfluidic chip used to construct placental tissue a. microengineered system for placenta[35]; b. a placenta-on-a-chip microdevice[36].

圖 3 微流控芯片構建子宮微環境的示意圖Fig. 3 Schematic diagrams of the microfluidic chip for construction of uterus microenvironment a. model for simulating the interaction between endometrial stromal cells (ESCs) and human peritoneal mesothelial cells (HPMCs)[40]; b. characterization of co-culture of endometrial stromal fibroblasts (stroma) and human peritoneal mesothelial cells (HUVECs) in the two-chamber device[41].

5.2.2子宮微環境

2012年，Chen等[40]報道了使用微流體通道與印章法培養子宮內膜基質細胞(ESCs)和人類腹膜間細胞(HPMC)來模擬腹膜后子宮內膜異位癥的病理生理微環境。研究在正常和病理狀態下實時監測ESCs和HPMC之間的相互作用(見圖3a)。Gnecco等[41]設計并開發了一個雙室微流體裝置,該裝置利用樹脂多孔膜,可以長期聯合培養人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)和子宮內膜基質細胞(見圖3b),從而體外構建子宮微環境。該報道檢測和分析了子宮內膜基質細胞和內皮細胞在類固醇調節作用下的相互作用。研究結果表明,基質細胞分化成功能性蛻膜細胞,發現了剪切應力可促進內皮細胞骨架排列和緊密連接的形成;子宮內膜血管間質瘤模型可持續4周對類固醇響應。這些數據表明,腹膜生理學可能對子宮內膜異位有重要作用。

5.2.3卵巢微環境

2017年,Xiao等[42]展示了一種多器官微流體系統(見圖4)。該系統在28 d產生小的卵巢卵泡,并調控女性生殖系統月經周期激素,為月經周期的激素信號和懷孕等的內分泌循環研究提供平臺,可用于藥物發現和毒理學等研究。Choi等[43]利用海藻酸鹽和膠原蛋白合成具有卵巢皮質和髓組織的卵巢微組織,并將其應用于早期的二級前卵泡的微型化3D培養。該研究開發的仿生卵巢微組織和微流體技術,對于改善體外培養的卵泡質量,以及了解卵泡發育和排卵機制具有十分重要的意義,同時有助于尋找因卵巢功能紊亂而導致不孕的治療方法。Nagashima等[44]利用灌流微流控系統體外培養家貓和狗卵巢皮質內或卵巢皮質外分離的卵泡,該系統是對大型哺乳動物(如貓、狗)卵巢體外培養系統進行改進的重要探索,在生育保存、生殖毒理學和瀕危哺乳動物保護等方面具有潛在的應用價值。

圖 4 微流控芯片卵巢組織構建的示意圖Fig. 4 Schematic diagrams of the microfluidic chip used to construct ovarian tissue a. multiple unit microfluidic platforms (MFP) systems[42]; b. microfluidic platform supported follicle maturation and hormone secretion in the solo-MFP system[43].

6 結論與展望

微生殖技術,包括微流控芯片和器官芯片,是通過廣泛的基礎科學和生物工程技術的結合而形成的。更好、更快、更準確,更“微觀”的技術是各個領域迫切的現實需求,而微生殖技術在生殖系統研究中才剛剛起步。在未來,研究人員可以通過整合不同組織(例如生殖系統器官、胎盤)或不同細胞類型(例如配子、腫瘤細胞)、結合生物因子(例如激素和信號分子)、利用分析化驗和技術(例如微型攝像頭、質譜分析等等)等多因素來研究生殖系統與疾病。微流控技術有望應用在輔助生殖、藥物測試和醫療診斷上,對生殖系統與疾病的研究具有無限潛能。