EGFR 和DNA-PKcs 與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系

曲媛媛 殷洪濤 張茵 王瑞芝 鄂明艷

肺癌在我國是發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的80%[1]，是臨床最常見也最難治的惡性腫瘤之一。患者的預(yù)后除與腫瘤分期、病理類型等有關(guān)，還與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、損傷修復(fù)、抗凋亡等相關(guān)基因的表達(dá)異常密切相關(guān)。其中，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）作為原癌基因-1（human epidermal growth factor receptor-1，her-1）的表達(dá)產(chǎn)物[2]，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。EGFR抑制劑對(duì)存在EGFR敏感性突變的非小細(xì)胞肺癌具有良好的治療效果[3-4]。EGFR的高表達(dá)則與放化療敏感性差，患者預(yù)后不良相關(guān)[5]。DNA依賴蛋白激酶催化亞基（DNAdependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）是參與DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)的重要激酶，在包括非小細(xì)胞肺癌的多種腫瘤組織中高表達(dá)[6]，臨床研究提示其表達(dá)程度與患者的預(yù)后具有相關(guān)性。然而EGFR和DNA-PKcs與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后效果及患者生存時(shí)間之間的關(guān)系研究較少。為明確EGFR和DNK-PKcs在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況，我們對(duì)2005年1月—2008年6月在我院行手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行了回顧性研究，現(xiàn)將其歸納如下。

1 材料與方法

1.1 臨床病例

將在我院行手術(shù)治療227例患者作為研究對(duì)象，女性73例，男性154例，平均年齡（55.8±9.4）歲。肺葉切除術(shù)208例，全肺切除術(shù)16例，袖狀切除術(shù)者3例。腺癌130例，鱗癌97例。根據(jù)第8版AJCC分期，I期32例，IIa期73例，IIb期68例，IIIa期52例，IIIb期2例。隨訪至2018年8月。術(shù)后化療者156例，術(shù)后放療者87例。

1.2 免疫組化染色

用切片機(jī)4 μm將組織芯片蠟塊連續(xù)切片，56℃水中展片后轉(zhuǎn)至載玻片上。處理如下：（1）脫蠟、水化；（2）抗原修復(fù)；（3）血清封閉；（4）在不同切片上分別滴加EGFR、DNA-PKcs的多克隆抗體，4℃孵育過夜；（5）PBS洗三次，2分鐘/次；（6）二抗孵育約1小時(shí)；（7）PBS洗三次，5分鐘/次；（8）DAB顯色5～10分鐘；（9）PBS沖洗5～10分鐘；（10）脫水、透明、封片。

1.3 結(jié)果評(píng)分

根據(jù)染色強(qiáng)度、陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分：染色強(qiáng)度：0（高倍鏡下為陰性）；1（弱，僅在高倍鏡下可觀察到）；2（中等，在低倍鏡下可觀察到）；3（強(qiáng)，在低倍鏡下可見明顯染色）。陽性細(xì)胞比例：0（無染色）；1（1%～25%）；2（26%～50%）；3（51%～75%）；4（76%～100%）。將以上兩項(xiàng)評(píng)分相加，得到范圍在0～7的總分，將染色結(jié)果分為四組：-（0）；+（1～2）；++（3～5）；+++（6～7）。EGFR及DNA-PKcs表達(dá)+++被認(rèn)為是高表達(dá)，+、++均被認(rèn)為是低表達(dá)。

表1 EGFR 和DNA-PKcs-、+、++、+++四種表達(dá)程度[例（%）]

1.4 觀察指標(biāo)

病理科查找2005年1月—2008年6月在我院行手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織蠟塊，進(jìn)行上述EGFR和DNA-PKcs的免疫組化染色，并對(duì)表達(dá)程度進(jìn)行評(píng)分，分為-、+、++、+++四組，病案室對(duì)這些患者的生存情況進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間至2018年8月10日。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Kaplan-Meier生存分析，Log-rank比較生存曲線間差異。

2 結(jié)果

2.1 EGFR和DNA-PKcs

肺癌患者EGFR和DNA-PKcs-、+、++、+++四種表達(dá)程度的患者例數(shù)見表1。

另外，EGFR和DNA-PKcs共高表達(dá)27例。肺腺癌130例，其中EGFR高表達(dá)23例，DNA-PKcs高表達(dá)64例；肺鱗癌97例，其中EGFR高表達(dá)19例，DNA-PKcs高表達(dá)46例。

2.2 生存時(shí)間分析

EGFR表達(dá)-、+、++、+++的患者的中位生存時(shí)間分別為35、37、35、34個(gè)月（P＞0.05）（圖1）。DNA-PKcs表達(dá)-、+、++、+++的患者的中位生存時(shí)間分別為37、34、32、33個(gè)月，陰性表達(dá)（-）和高表達(dá)（+++）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。總體中位生存時(shí)間為35個(gè)月。中位生存時(shí)間EGFR和DNAPKcs共高表達(dá)為27個(gè)月，非高表達(dá)患者為36個(gè)月，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

3 討論

圖1 EGFR 表達(dá)-、+、++、+++患者的生存曲線

圖2 DNA-PKcs 表達(dá)-、+、++、+++患者的生存曲線

圖3 EGFR 和DNA-PKcs 共高表達(dá)患者與非高表達(dá)患者的生存曲線

在非小細(xì)胞肺癌中，約50%～80%存在EGFR的高表達(dá)，EGFR高表達(dá)多導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)放化療產(chǎn)生抗拒，因而導(dǎo)致患者的預(yù)后不良[7]。通過對(duì)患者長期隨訪研究發(fā)現(xiàn)，EGFR的表達(dá)程度與患者的生存并無顯著相關(guān)，EGFR不表達(dá)患者的中位生存時(shí)間為35個(gè)月，高表達(dá)患者的中位生存時(shí)間為34個(gè)月。因此，EGFR的表達(dá)并不能作為患者預(yù)后的獨(dú)立評(píng)價(jià)因素。DNAPKcs定位于細(xì)胞核，與Ku70、Ku80共同組成DNA-PK復(fù)合物，參與DNA雙鏈斷裂的非同源末端連接修復(fù)[8]。DNA-PKcs在包括非小細(xì)胞肺癌的多種腫瘤組織中高表達(dá)，有研究報(bào)道非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中DNA-PKcs的表達(dá)高于周圍正常肺組織，且腫瘤與正常組織的DNA-PKcs表達(dá)比值高與患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加呈相關(guān)[9-10]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，DNA-PKcs在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)率達(dá)48%，且高表達(dá)患者與陰性表達(dá)患者之間的中位生存時(shí)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為33個(gè)月及37個(gè)月。為明確EGFR和DNA-PKcs同時(shí)高表達(dá)患者的生存情況，我們發(fā)現(xiàn)，EGFR和DNA-PKcs同時(shí)高表達(dá)患者中位生存時(shí)間為27個(gè)月，低于非同時(shí)高表達(dá)的患者，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此說明，即使兩個(gè)分子聯(lián)合檢測(cè)，也不能對(duì)非小細(xì)胞肺癌的長期生存預(yù)后做出預(yù)測(cè)。非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后是多因素共同決定的，研究證明，僅通過一兩項(xiàng)腫瘤發(fā)生相關(guān)的生物大分子的檢測(cè)不能直接對(duì)患者的預(yù)后做出判斷。多項(xiàng)研究表明EGFR經(jīng)胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核后，EGFR可作為共轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，如COX-2、cyclinD1等，也可以與DNA-PKcs形成復(fù)合物，使DNAPKcs的活性增強(qiáng)[11-12]。

綜上所述，EGFR和DNA-PKcs在非小細(xì)胞肺癌的腫瘤組織中均存在不同程度的表達(dá)，雖然EGFR的表達(dá)程度與患者的生存時(shí)間無顯著相關(guān)，但更深入的研究其在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性具有潛在意義。DNA-PKcs高表達(dá)則提示患者的生存時(shí)間短，對(duì)于患者預(yù)后的判斷具有一定的提示作用。