熒光原位雜交技術在檢測自然流產組織染色體數目異常中的價值和意義

鄢 磊 張雪瑞 曹東華

（1 大連市婦幼保健院遺傳代謝實驗中心，遼寧 大連 116001； 2 大連市婦幼保健院遺傳代謝中心，遼寧 大連 116001）

流產是指孕婦懷孕不足28周、胎兒體質量低于1 kg而導致妊娠過程終止，在產科中極為常見。自然流產，是指在多種共同病因影響下未采用人工方式而導致妊娠終止的流產，占流產的10%～15%[1]，自然流產的病因復雜，但半數以上的自然流產均為胚胎染色體異常，其他還有母體免疫因素、宮內感染等等。熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）是采用非射性技術對流產所分泌出的組織進行DNA的定性、定量或相對定位分析，其具有操作簡便、分析快速、準確度高等優點，能為自然流產的病因的診斷提供較為準確的理論依據[2]。本院自2014年開展熒光原位雜交技術以來，取得不俗的效果，現將其應用過程報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2014年1月至2017年12月在我院自然流產檢查的240例絨毛組織。孕婦年齡范圍為18～44歲，平均年齡（28.3±3.5）歲；年齡大于35歲孕婦有98例，年齡小于35歲孕婦有142例；流產次數在3次（包含3次）以上者80例，流產次數在3次以下者有160例。本次研究內容均告知孕婦及家屬，取得其同意后進行。

1.2 方法：①標本收集及處理：取待檢對象的絨毛組織，去除蛻膜、血塊等雜質后，剪碎后進行離心，60%冰乙酸用力吹打1min消化，去掉上清液以后進行滴片（去除上清液以后須加一定量的固定液方便滴片），滴片完成于室溫下保存24 h方進行下一步操作。②玻片預處理及變性雜交：室溫下將玻片置于中性SSC溶液中進行漂洗，時長為5 min，其后采用胃蛋白酶進行消化，并再次將玻片置于中性SSC溶液中進行漂洗；其后按照70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇的順序將玻片進行脫水（時長均為3 min），其后10 μL探針混合物滴加于玻片雜交區域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊；雜交儀共變性，共變性條件：75 ℃，5min，雜交條件：42 ℃，16 h。③共變性后處理及檢測：上述處理完成后，將載玻片上的蓋玻片移出，其后放入46 ℃的生理鹽水水浴鍋中將玻片進行漂洗，漂洗時長為10 min，漂洗過程中注意對玻片進行振蕩；上述步驟完成后將玻片置于46 ℃水浴鍋（水浴鍋為0.1% NP-40/2×SSC溶液）進行漂洗，漂洗時長為10 min，漂洗過程中注意對玻片進行振蕩；上述步驟完成后將玻片置于70%乙醇中進行漂洗，漂洗時長為5 min。其后取出玻片將玻片進行風干；玻片風干后，將15 μL DAPI 復染劑加至目標區域，立即蓋上蓋玻片，暗處放置10～20 min后觀察組織的染色體情況。④試劑：本次選用的FISH試劑盒為金菩嘉試劑盒，購于北京金菩嘉醫療科技有限公司（國食藥監械字2012第3400283號），主要包括GLP13/GLP21（綠/紅標記）、GLP16/GLP22（紅/綠標記）、CSP18/CSP X/CSP Y（藍/綠/紅標記）。

1.3 診斷標準：所選取的樣本中，其細胞計數須大于100個，當檢測到異常多于60%時即視為陽性，低于10%視為陰性，在10%～60%為嵌合體。

1.4 統計學方法：本次研究所有數據的處理均采用SPSS20.0處理，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。組內不同時間點的比較采用重復測量設計的方差分析。計數資料用頻數和率表示，組間比較采用χ2檢驗。檢驗標準α=0.05，當P＜0.05表示有統計學意義。

2 結 果

在240例自然流產的絨毛組織中，檢出染色體異常共計110例，異常率為45.83%。異常分布類型見表1。在高齡妊娠和非高齡妊娠孕婦中，異常率比較無差異（P＞0.05）。見表2。在反復流產與非反復流產孕婦中，其異常率比較無差異（P＞0.05）。見表3。

3 討 論

隨著生活模式的轉變，近年來，流產率尤其是自然流產人數，越來越高。導致自然流產的原因是多種多樣的，包括免疫因素、感染、內分泌異常以及其他未知因素，但最為重要的仍然是染色體異常[3]。染色體異常又以13、18、21、X和Y染色體異常占多。絨毛細胞為在胎盤和子宮壁之間的接觸面上，密生的指狀或樹枝狀小突起的細胞團，其與胎兒具有相同的染色體類型，因此絨毛組織是對胎兒染色體異常進行診斷的重要物質基礎。

表1 FISH檢測結果分布

表2 高齡孕婦與非高齡孕婦異常率比較

表3 反復流產孕婦與非反復流產孕婦異常率比較

絨毛組織通常在自然流產胎兒停止發育后由陰道娩出，因此絨毛組織常常被污染，對于普通方法提取絨毛組織染色體而言具有難度且易被干擾。FISH是一種能夠快速檢測組織染色體的技術，其主要原理為通過熒光素將特制的染色體探針進行標記，這些探針特異性識別染色體并與之結合，結合后這些熒光素能將染色體顯影出來，對于染色體數目異常具有良好的診斷效果[4]。本次發現，對240例絨毛組織顯影發現，有110例絨毛組織出現了異常，異常率為45.83%，與以往文獻報道相差不大[5]，同時在這些異常中16-三體、X單體異常所占比例最多。

本次研究還比較了高齡孕婦（大于35歲）與多次流產（3次以上）的異常率，發現高齡孕婦與非高齡孕婦之間的異常率并無差異，而多次流產與非多次流產孕婦之間異常率也無差異。提示孕婦自然流產次數、孕婦年齡與胚胎染色體異常的發生率無明顯相關性。

綜上所述，熒光原位雜交技術在對由染色體異常導致的自然流產的檢測中，具有準確度高、操作簡便等特點，能為快速診斷自然流產的病因提供準確的理論依據。