神經型一氧化氮合酶不同位點磷酸化在大鼠神經病理性疼痛中的作用機制

張博涵，董道松，郭欣欣，陶學恕，趙夢楠，王品瑩，樊修元，宋濤

（1.中國醫科大學附屬第一醫院疼痛科，沈陽 110001；2.錦州醫科大學附屬第三醫院麻醉科，遼寧 錦州 121000）

神經病理性疼痛是一種難治性疾病，其發病機制尚不明確，目前認為在此過程中，一氧化氮（nitric oxide，NO）發揮了關鍵作用。實驗證明，大鼠髓腔內給予NO供體（釋放NO）可以直接引起神經病理性疼痛的疼痛反應，而使用NO清除劑減少NO生成可以減輕疼痛［1］。這表明NO參與了神經病理性疼痛的發生與維持。NO由一氧化氮合酶合成，一氧化氮合酶共有3種亞型，包括神經型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、內皮型一氧化氮合酶和誘導型一氧化氮合酶。其中nNOS被證實在神經病理性疼痛的發病機制中起重要作用［2］，nNOS基因敲除可以減輕疼痛反應。

nNOS活性的調節可通過自身不同位點的磷酸化來實現。本課題組前期研究發現，nNOS Ser847位點的磷酸化可以使nNOS活性降低［3］，而Ser1417位點的磷酸化可以增加nNOS活性［4］。目前在大鼠腦損傷模型的海馬以及大鼠脊髓損傷模型的脊髓組織中，分別檢測出了nNOS Ser847的磷酸化［5］。本研究擬觀察在神經病理性疼痛發生時，脊髓中的nNOS是否發生了磷酸化及其與疼痛的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

選用180～220 g標準月齡的SD大鼠（遼寧長生生物公司提供）56只，于SPF級動物實驗室內分籠飼養，自由飲食，每日更換墊料。

鈣離子鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）抑 制 劑KN-93和PKB/Akt抑制劑Wortmannin購自美國Sellct公司，溶于DMSO中，濃度分別為30 nmol/μL和40 nmol/μL。nNOS NP847兔單克隆抗體、nNOS NP1417兔單克隆抗體、辣根酶標記山羊抗兔抗體購自美國Abcam公司，SDS-PAGE快速凝膠試劑盒購自江蘇凱基生物技術公司，能與nNOS特異性結合的2'-5'-ADP-agarose購自美國Sigma公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自弗德生物技術公司，磷酸化蛋白酶抑制劑購自美國Roche公司，RIPA裂解液購自碧云天生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 建立坐骨神經分支損傷（spared nerve injury，SNI）疼痛模型：參考文獻［6］，異氟烷充分麻醉后，在大鼠右側后肢股骨中點下方1 cm處切口，鈍性分離后，暴露坐骨神經分支，可見坐骨神經于近膝關節處分為腓總神經、脛神經以及腓腸神經，將腓總神經、脛神經結扎并離斷，僅剩腓腸神經，充分止血后縫合。

1.2.2 測量大鼠疼痛縮足閾值（pain withdrawal threshold，PWT）：建立模型后，每天使用纖毛測試棒測試大鼠機械痛敏。采用不同粗細磅數的von Fray纖毛測試棒刺激大鼠足底及外側足跟部至略微彎曲并持續5 s以上，若大鼠出現縮足反應則為陽性，記錄此磅數，并根據CHAPLAN等［7］的方法處理數據，得到大鼠50% PWT。計算數值時，為了更加直觀，采用log PWT進行分析。

1.2.3 鞘內置管：鞘內置管是將塑料毛細管置于大鼠椎管內，并將其固定于體外，以便于長期給藥的一種給藥方式。與傳統的鞘內注射相比，鞘內置管具有效果更明確、大鼠術后生存率更高、給藥時間更長等優點。大鼠麻醉后，于背部切開一縱行切口，鈍性分離肌肉與皮膚，選用PE10導管在使用前進行消毒，并用生理鹽水預充，置入穿刺針中，標記好長度。在穿刺針外預留1.5～2.5 cm。于L5～6或L6～S1節段進行穿刺，穿刺成功時，大鼠會有甩尾動作，此時將PE導管置入椎管內1～1.5 cm。將導管置入后拔出穿刺針，將導管分別固定于椎間及椎旁韌帶上。利用硬膜外穿刺針行皮下隧道，將PE管從穿刺點引出至枕骨大孔處，皮膚外留置1.5～2.0 cm。可在導管中鞘內注射10 μL的1%利多卡因，并在末端套上塑料帽，將導管和塑料帽固定至皮膚，可將藥物自體外導管口輸入至椎管內。在大鼠蘇醒后，測試大鼠麻醉平面和節段。正常狀態下平面應在L3～6，鞘內置管后，在實驗組中鞘內注射30 nmol/μL的KN-93 10 μL，對照組中注射DMSO 10 μL，每日連續給藥［8］。

1.2.4 采用Western blotting測定樣品中蛋白表達情況：將大鼠按實驗預計天數處死后，取腰段脊髓并稱重，在RIPA裂解液中加入磷酸化酶抑制劑。在每個樣品中加入400 μL裂解液，超聲裂解后4 ℃、15 000 r/min離心15 min取上清。采用BCA法定量蛋白濃度，取相同量蛋白配至300 μL，加入20 μL 2'-5'-ADP-agarose混合2 h，離心棄上清。清洗3次后，加入25 μL蛋白上樣緩沖液煮沸3～5 min，離心取上清，放置至室溫后于-20 ℃冰箱保存，用于Western blotting［9］。

1.2.5 檢測nNOS Ser847及Ser1417磷酸化：按照隨機分組的原則，將32只大鼠隨機分為對照組、假手術組以及SNI 模型組，其中SNI模型組在大鼠的右側后肢建立SNI模型，根據術后天數的不同分為SNI模型1、3、7、10、14、21 d組，每組4只。假手術組只暴露神經，不結扎直接縫合。對照組不做任何處理。

1.2.6 檢測CaMKⅡ及PKB/Akt阻斷劑的作用：取24只SD大鼠再分組，隨機分為6組，每組4只。假手術組：大鼠暴露神經后不結扎神經直接縫合；SNI模型組：建立SNI模型后不進行鞘內注射，并根據術后天數不同分為SNI模型7、10 d組；DMSO組：建立SNI模型后鞘內注射DMSO；KN-93組：建立SNI模型后鞘內注射KN-93；Wortmannin組：建立SNI模型后鞘內注射Wortmannin。

1.3 統計學分析

Western blotting法顯色后的條帶導出后，采用ImageJ 圖像分析軟件分析各條帶灰度值，得到的數據采用SPSS 20.0軟件進行分析。數據用x-±s表示，2組比較采用t檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PWT檢測結果

各組大鼠PWT的基線值無統計學差異（P＞0.05）。SNI模型建立后，SNI模型組與對照組、假手術組相比PWT顯著降低（P＜ 0.001），SNI模型1 d組與假手術組相比有統計學差異（P＜ 0.001），SNI模型10 d組與假手術組相比仍有統計學差異（P＜ 0.001）且PWT值相對最低，然而從14 d開始PWT呈逐漸增加的趨勢。SNI模型組術后各時間點間比較，PWT無統計學差異（P＞ 0.05）。見圖1。

2.2 神經病理性疼痛大鼠脊髓nNOS磷酸化表達情況

圖1 SNI模型建立后大鼠后足PWT明顯降低Fig.1 The pain withdrawal threshold of the hind paw was significantly reduced after the establishment of the SNI model in rats

2.2.1 nNOS Ser847的磷酸化表達情況：對各個樣本中nNOS Ser847磷酸化進行檢測，結果發現，SNI模型10 d組的磷酸化程度最高，與術前相比有統計學差異（P＜ 0.001），10 d后Ser847的磷酸化水平呈逐漸減少趨勢。見圖2A。

2.2.2 nNOS Ser1417的磷酸化表達情況：對各個樣本中nNOS Ser1417磷酸化進行檢測，結果發現，疼痛發生后磷酸化量迅速上升。SNI模型1 d組磷酸化表達量最多，與術前相比差異有統計學意義（P＜ 0.05），術后各時間點間比較無統計學差異（P＞ 0.05）。見圖2B。

2.3 鞘內注射實驗中nNOS磷酸化的變化

圖2 神經病理性疼痛模型大鼠脊髓中nNOS在不同位點發生磷酸化Fig.2 Phosphorylation of nNOS at different sites in the spinal cords of SNI model rats

2.3.1 鞘內注射KN-93后nNOS Ser847磷酸化表達量的變化：術后第1天開始鞘內注射KN-93，取nNOS Ser847磷酸化水平最高的10 d時檢測大鼠脊髓中Ser847磷酸化。SNI模型10 d組與假手術組相比磷酸化明顯增加，有統計學差異（P＜ 0.001）；DMSO組與SNI模型10 d組相比無統計學差異（P＞ 0.05）；而KN-93組與SNI模型10 d組相比磷酸化明顯減弱，有統計學差異（P＜ 0.05）。見圖3A。

2.3.2 鞘內注射Wortmannin后 nNOS Ser1417磷酸化表達量的變化：從術后第1天開始鞘內注射Wortmannin，至術后7 d時，檢測大鼠脊髓中nNOS Ser1417磷酸化。結果發現，SNI模型7 d組與假手術組相比磷酸化明顯增加，有統計學差異（P＜ 0.05）；DMSO組與SNI模型7 d組相比無統計學差異（P＞ 0.05）；而Wortmannin組與SNI模型7d組相比磷酸化明顯減弱，有統計學差異（P＜ 0.01）。見圖3B。

圖3 鞘內給予蛋白激酶抑制劑后nNOS磷酸化的表達降低Fig.3 The phosphorylation of nNOS was decreased after intrathecal injection of protein kinase inhibitors

3 討論

本課題組前期研究［4］發現，蛋白激酶CaMKⅡ可以使nNOS發生Ser847位置的磷酸化并使其活性下降，PKB/Akt則可以使nNOS發生Ser1417位置的磷酸化并使其活性上升。研究［10］發現，nNOS Ser847位置的磷酸化在腦缺血、脊髓損傷等動物模型中出現，并通過降低nNOS活性、減少NO合成而發揮了重要作用。而在蛛網膜下腔出血、腦缺血再灌注損傷中發現，nNOS發生了Ser1417位置的磷酸化，并導致NO合成增多［11］。CaMKⅡ、PKB/Akt、nNOS在脊髓都有表達，而發生在脊髓背角的中樞敏化是神經病理性疼痛重要的發生機制，CaMKⅡ與nNOS在此過程中均起到了關鍵的作用，而nNOS磷酸化的作用尚不清楚［12］。

本研究證實了在大鼠SNI模型中，脊髓的nNOS發生了Ser847和Ser1417的磷酸化。其中Ser847磷酸化在神經損傷后的第10天最多，而后逐漸減少。而Ser1417的磷酸化在神經損傷后的第1天就達到最高，而后亦維持了較高的水平。與此同時，代表機械痛閾的大鼠PWT，在神經損傷后第1天即顯著下降，至第10天達到最低，疼痛最為劇烈，而后逐漸緩解。這一現象考慮為神經損傷后nNOS迅速發生的Ser1417磷酸化，導致NO大量合成，加重了神經病理性疼痛的痛覺超敏，使其PWT在Ser1417磷酸化最大化的術后第1天即顯著下降。而nNOS的Ser847磷酸化可以降低nNOS活性，減少NO合成，并緩解疼痛。本研究發現，在Ser847磷酸化最大化的第10天，大鼠PWT亦達到最低，而后疼痛開始逐漸緩解。說明nNOS不同位點的磷酸化均參與了神經病理性疼痛的發生與維持，但起到了不同的作用。這種nNOS在同一疾病中，同時被不同蛋白激酶磷酸化不同位點的現象，在其他研究中也有報道，如在神經損傷導致陰莖勃起障礙的動物模型中，就同時觀察到了nNOS Ser847與Ser1417的磷酸化，且起到了不同的作用［13］。

很多蛋白激酶都可以使nNOS發生磷酸化，如PKC、CaMKⅡ、RSK1可以使nNOS發生Ser847磷酸化，而Akt、PKA、PKD等可以使nNOS發生Ser1412磷酸化［14］。本研究采用鞘內置管的方法，精確給予CaMKⅡ阻斷劑KN-93，可以顯著逆轉神經損傷導致的nNOS Ser847磷酸化，證明SNI大鼠神經損傷后CaMKⅡ被激活，并使nNOS發生Ser847磷酸化，降低了nNOS活性，在神經病理性疼痛中起到了保護作用。與此同時，本研究采用PKB/Akt阻斷劑Wortmannin逆轉了nNOS Ser1417的磷酸化，證實PKB/Akt使nNOS發生Ser1417的磷酸化，增強了nNOS的活性，在神經病理性疼痛中起到了致痛作用。

綜上所述，本研究揭示了nNOS不同位點的磷酸化在神經病理性疼痛中發揮了不同的作用。提示將來臨床上，在神經病理性疼痛的不同時間點，以不同的蛋白激酶及nNOS不同的磷酸化位點為靶點進行治療，可能取得良好的效果。