RNA干擾沉默水通道蛋白3基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞SMMC-7721增殖和凋亡的影響

付雪巖，王雅瑋，王文青，吳剛

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.普通外科；2.老年外科，沈陽 110001）

水通道蛋白3（aquaporin3，AQP3）屬于水通道蛋白家族（aquaporins，AQPs），是一種位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞膜上組成“孔道”，可控制水、甘油和其他一些小溶質(zhì)分子在細(xì)胞內(nèi)外的進(jìn)出［1］。目前，AQP3被認(rèn)為與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］。在肝癌中，相對于癌旁組織，AQP3在肝癌組織中表達(dá)明顯升高并且與肝癌的分級、分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)［3-5］。本研究中通過干擾沉默人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的AQP3基因的表達(dá)，檢測其對細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響，初步探討AQP3與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，可能為肝癌的診斷和治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)和方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購于中國科學(xué)院（中國上海）。DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和100 U/mL青霉素和鏈霉素（美國Hyclone公司）。在37 ℃下、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將SMMC-7721細(xì)胞接種在6孔板中，并培養(yǎng)直至達(dá)60%融合。去除6孔板中含有的血清，采用Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC、siRNA-AQP3#1和siRNA-AQP3#2（蘇州吉瑪制藥技術(shù)有限公司），繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行相關(guān)研究。將細(xì)胞分為4組：空白對照組、siRNA-NC組、siRNA-AQP3#1組和 siRNA-AQP3#2組。siRNA-AQP3#1和siRNA-AQP3#2序列如下：siRNA-AQP3#1 F，5'-CC UUUGCCAUGUGCUUCCUTT-3'；R，5'-AGGAAGCA CAUGGCAAAGGTT-3'。siRNA-AQP3#2 F，5'-CCCU UAUCGUGUGUGUGCUTT-3'；R，5'-AGCACACACA CGAUAAGGGTT-3'。

1.3 RNA提取和qRT-PCR

參照Trizol說明書提取SMMC-7721總RNA。然后使 用GoScriptTMReverse Transcription Mix，Random Primers試劑盒（美國Promega公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后在ABI PRISMR 7500（美國ABI公司）PCR儀上進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，cDNA擴(kuò)增使用GoTaqR qPCR Master Mix（美國Promega公司），采用兩步法標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增程序：第1步（預(yù)變性）95 ℃ 2 min 1個(gè)循環(huán)；第2步（PCR反應(yīng)）95 ℃ 15 s，60℃，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)CT值通過公式2-ΔΔCt進(jìn)行相對定量分析計(jì)算得AQP3mRNA相對表達(dá)量。AQP3的引物及內(nèi)參β-actin［10］由生工生物工程（中國上海）公司合成。AQP3F，5'-CCGTGACCTTTGCCATGTG-3'；R，5'-CGAAGTGCC AGATTGCATCATAA-3'。β-actinF，5'-CGTCATAC TCCTGCTTGCTG-3'；R，5'-GTACGCCAACACAGTG CTG-3'。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化并收集4組細(xì)胞，1 000 r/min離心，去上清，加入完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度到5×103/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，每孔設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK8試劑（中國碧云天公司），繼續(xù)在培養(yǎng)箱孵育1.5 h，在酶標(biāo)儀上選擇450 nm波長測定每孔的吸光度值，描繪生長曲線。對于平板克隆實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞以1 500/孔接種在6孔板上2周。然后，用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffer saline，PBS）洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，最后計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測

按照凋亡試劑盒（日本Dojindo Labotories公司）說明書操作，胰酶消化并收集4組細(xì)胞，PBS洗滌2次，并收集約5×105細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min 后加入100 μL Annexin V緩沖液懸浮細(xì)胞，最后分別加入PI和Annexin-V染液吹打混勻，室溫避光染色15 min加入400 μL Annexin V緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.6 Western blotting

足量的4組細(xì)胞常規(guī)消化離心，在冰上裂解，將得到的裂解物離心，取上清，并用BCA法測定濃度，樣品均定量為5 μg/μL，變性，取50 μg蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，70 V 80 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉90 min。孵育一抗（1∶1 000），4 ℃過夜孵育。次日，TBST洗膜后室溫孵育二抗2 h（1∶10 000），TBST清洗，最后在ECL儀上完成發(fā)光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾沉默后AQP3表達(dá)水平的檢測

采用RNA干擾技術(shù)沉默AQP3基因，實(shí)時(shí)PCR及Western blotting 分析處理后的4組細(xì)胞的AQP3mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，siRNA-AQP3#1組（0.276 9±0.047 78）和siRNA-AQP3#2組（0.462 9±0.084 02）的AQP3mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯下調(diào)（圖1），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001，P＜ 0.01）。說明AQP3 siRNA轉(zhuǎn)染可以有效的干擾沉默AQP3mRNA和蛋白的表達(dá)。

2.2 CCK-8和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

圖1 干擾后AQP3 mRNA和蛋白表達(dá)水平Fig.1 AQP3 mRNA and protein expression levels after interference

使用CCK-8方法對4組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h的活力進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)siRNA-AQP3#1組（59.00±4.583）和siRNA-AQP3#2組（68.33±7.024）均表現(xiàn)出明顯的活力降低，說明細(xì)胞增殖能力減弱。平板克隆集落形成實(shí)驗(yàn)也得到相似的的結(jié)果（圖2），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

圖2 各組處理因素對細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of the treatment factors on the cell proliferation ability of each group

AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，siRNA-AQP3#1組（10.6±0.413 1）和siRNA-AQP3#2組（8.22±0.353 0）的凋亡比率明顯高于其余2組（圖3），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001，P＜ 0.01）。說明沉默AQP3能夠明顯促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞的凋亡。

圖3 各組處理因素對細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of the treatment factors on apoptosis in each group

3 討論

肝細(xì)胞癌是世界上第五大常見的癌癥，并且也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，大多數(shù)患者在疾病的晚期被診斷出來，失去手術(shù)治療機(jī)會，且預(yù)后較差［6-7］。過去幾十年，人們一直致力于肝癌的分子機(jī)制研究，而隨著醫(yī)學(xué)分子技術(shù)的發(fā)展，眾多關(guān)于肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子被發(fā)現(xiàn)及研究，對于肝癌的診斷及治療有著重大的意義。

AQPs是一類內(nèi)在膜蛋白通道，其促進(jìn)水和小分子（如甘油）通過由滲透或溶質(zhì)梯度驅(qū)動的細(xì)胞膜擴(kuò)散。在哺乳動物中表達(dá)的13種同種型（AQP0～12）對水穩(wěn)態(tài)和能量平衡起著至關(guān)重要的作用［8-9］。AQP3基因位于人染色體9p13.3，其在多種上皮細(xì)胞的基底外側(cè)質(zhì)膜中表達(dá)。在胃腸道中，AQP3在胃黏膜組織、回腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸中表達(dá)，有助于水和甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)。在呼吸道中，AQP3在上呼吸道和下呼吸道中表達(dá)，能夠促進(jìn)穿過氣道上皮細(xì)胞的滲透水的運(yùn)輸。此外，AQP3在腦、乳腺、肝臟、胰腺、卵巢、前列腺和膀胱等上皮細(xì)胞中都有表達(dá)［2］。近些年來，隨著先進(jìn)的分子技術(shù)對AQPs研究的深入，越來越多的研究證據(jù)表明，AQP3在癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。除了膀胱癌，AQP3在大多數(shù)癌癥中都呈高表達(dá)，具體的作用機(jī)制尚不清楚，可能通過影響細(xì)胞增殖、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程以及潛在的下游調(diào)控元件參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。例如，在胰腺癌中，AQP3通過調(diào)節(jié)mTOR信號傳導(dǎo)促進(jìn)胰腺癌的增殖生長［10］；在胃癌中，AQP3參與細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程，并且可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/SNAIL信號通路參與胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程［11］；在乳腺癌中，AQP3通過調(diào)節(jié)H2O2轉(zhuǎn)運(yùn)及其下游細(xì)胞信號傳導(dǎo)控制乳腺癌細(xì)胞的遷移過程［12］。

本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的AQP3表達(dá)，沉默后的mRNA和蛋白水平明顯下降，說明AQP3 siRNA起到了很好的干擾效果。此外，沉默AQP3引起的SMMC-7721細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞凋亡增加，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。隨著對AQP3在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中作用機(jī)制的深入研究，相信AQP3未來將作為肝癌生物治療的新靶點(diǎn)，在肝癌的早期診斷、早期治療中發(fā)揮更為重要的作用。