死后角膜數字圖像變化與死亡時間關系的實驗性研究

鄭吉龍，霍德民，鄧湘渝，騰月，王玖琳，單迪，賈儒林，鐘浩鵬

（1.中國刑事警察學院法醫學系法醫病理教研室，沈陽 110035；2.上海市公安局嘉定分局刑偵支隊，上海 201822；3.南昌市公安局刑偵大隊，南昌 330000）

死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷一直是困擾法醫學者們的難題之一。準確的PMI推斷對于指導偵查工作方向具有重要意義。利用個體死后角膜變化推斷PMI的做法由來已久，肉眼觀察死后角膜混濁程度進而粗略估計PMI的方法由于主觀性強且缺乏量化指標導致誤差較大［1］。有學者探索通過測量死后角膜厚度變化［2-3］、分析死后角膜上皮和內皮細胞核酸降解程度［4-5］等推斷PMI，但因破壞眼球組織結構及操作復雜，而未能實際應用。近年來，有研究［6-9］通過數字圖像處理技術量化死后角膜數字圖像變化，以期建立無創、客觀地推斷PMI的方法，但也因現場光源限制，圖像陰影致局部失真，及角膜圖像采集操作繁瑣等未能得以應用。本研究應用自制的提供固定暗室條件并自帶光源的便攜式“死后角膜圖像采集系統”，結合數字圖像處理技術量化分析死后角膜圖像顏色變化，并進一步驗證了該方法于不同環境下推斷PMI的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：健康成年新西蘭大白兔40只，雌雄不限，體質量2.0～2.5 kg，購自沈陽醫學院實驗動物研究中心。給予充足淡水和食物，于20 ℃室內飼養。所有家兔眼部均未患疾病。

1.1.2 實驗裝置：本課題組研究設計并制作的“死后角膜圖像采集系統”（圖1）主要由智能手機（2 000萬像素，分辨率5 120×3 840，華為Mate10，深圳華為終端有限公司）和附件裝置組成。附件主體為一白色泡沫圓筒（內壁直徑5.0 cm，高6.0 cm），內壁頂端固定一環形LED吸頂燈（冷光源，10 W，6 400 K色溫，上海歐普照明股份有限公司），能輸出強度均勻且恒定的光源，并可通過數據線接口連接移動電源（20 000 mAh，華為AP20Q，深圳華為終端有限公司）供電。圓筒頂端中央設一視窗，手機攝像頭（白平衡、測光模式、曝光模式、對焦模式均設置為自動模式）剛好可透過該窗孔拍攝。圓筒開口端套有薄層環形海綿，以緊密貼合眶周。

圖1 死后角膜圖像采集系統示意圖Fig.1 Schematic diagram of postmortem corneal image acquisition system

1.2 方法

1.2.1 動物分組：將家兔隨機分為實驗組（37只家兔，74只兔眼）和驗證組（3只家兔，6只兔眼）。適應性飼養3 d后，采用縊死死亡模型［10］處死家兔。實驗組家兔死后均置于溫度20 ℃、濕度30%的避光室內；驗證組3只家兔死后，隨機編碼為A、B、C，分別置于溫度20 ℃、濕度30%的密閉暗室內（A）、密閉自然光照室內（B）及溫度（20±5）℃、濕度30%～60%的密閉自然光照室內（C）。除采集角膜圖像時，兔眼瞼全程保持閉合狀態。

1.2.2 圖像采集與分析：死后72 h內每隔1 h采集家兔角膜圖像，以jpg格式儲存于手機中。每只兔眼各時間點分別采集3張圖像。將角膜圖像導入計算機，應用MATLAB軟件［11］（R2013a，美國MathWorks公司）分割得到兔角膜瞳孔區域圖像，并提取圖像的紅（red，R）、綠（green，G）、藍（blue，B）、色調（hue，H）、飽和度（saturation，S）、明度（brightness，V）6項顏色指標數值［12］。每個時間點各指標數值取3張圖像檢測的平均值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件分析縊死后兔角膜瞳孔區域圖像的6項顏色特征參數與PMI的相關性，建立相關回歸方程；分析與PMI相關性最高的參數在相同條件下的個體內及個體間差異，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

1.4 可行性驗證實驗

為驗證“死后角膜圖像采集系統”結合數字圖像分析技術于不同環境下推斷PMI的可行性，于驗證組家兔死后72 h內每隔1 h進行角膜圖像采集，再經圖像分割及特征提取處理后，選擇預先建立的判定系數最高的回歸方程，分析得出PMI。每只兔眼每次采集3張圖像，PMI預測值取3次測量的平均值，將推斷的PMI與實際PMI進行配對t檢驗，用獲得的標準差對盲測結果的準確率進行評價。盲測結果的準確率以差值的絕對值在標準差范圍內為準。

2 結果

2.1 角膜圖像顏色特征參數與PMI的回歸分析

回歸分析結果如表1所示，R、G、B與PMI相關性較強，經方差檢驗均有統計學意義，其中R與PMI的相關性最好；H、S、V與PMI相關性較差，經方差檢驗均無統計學意義。

2.2 個體內及個體間的差異分析

從實驗組37組實驗樣本數據中隨機抽取4組，用于分析相同條件下R值在個體內及個體間的差異性。結果顯示，死后72 h內，同一個體內及不同個體間兔角膜瞳孔區域圖像的R值隨PMI延長均呈上升趨勢，死后20 h內，R數值變化趨勢較為平緩，20 h后變化較為迅速（圖2～3）。不論個體內或個體間，不同PMI的R值之間有統計學差異（P＜ 0.01）；而相同死后時間的同一個體內及不同個體間的R值差異并無統計學意義（P＞ 0.05）。

表1 死后72 h內家兔角膜瞳孔區域圖像6項顏色特征參數與PMI的回歸方程Tab.1 Regression equations between PMI and six color features in the corneal pupil region images of rabbits within 72 hours after death

圖2 同一樣本內左、右角膜瞳孔區域圖像R值隨PMI推移變化趨勢比較Fig.2 Comparison of variation trend of R values in the left and right corneal pupil region images of the same sample with the prolongation of PMI

2.3 可行性驗證實驗結果

由于R值與PMI相關性最高，且在相同條件下R值在個體內及個體間差異均無統計學意義，故選擇反映R與PMI相關性的回歸方程用于驗證實驗。結果如表2所示，A組與B組PMI預測結果基本一致，預測標準差均在2 h以內，總體預測準確度達94%；C組PMI預測標準差在3.5 h以內，總體預測準確度達73%。此外，隨著PMI延長，PMI預測誤差范圍也逐漸增大，且C組增大幅度明顯高于A、B組。

圖3 不同樣本間角膜瞳孔區域圖像R值隨PMI推移變化趨勢比較Fig.3 Comparison of variation trend of R values in the corneal pupil region images of the different samples with the prolongation of PMI

表2 可行性驗證實驗結果Tab.2 Results of feasibility verification experiments

3 討論

智能手機數字圖像是采用數碼技術與照相攝影技術的完美結合體［13］。但光線強度、拍攝角度與高度的變化及手機圖像采集器的像素等都會最終影響拍攝圖像的色彩，從而對后續色彩定量分析結果產生較大影響。本研究采用的“死后角膜圖像采集系統”限制了手機圖像采集器配置，統一采用華為智能手機（2 000萬像素，分辨率5 120×3 840，華為 Mate10），且圖像采集過程中固定手機相關拍攝參數（白平衡、測光模式、曝光模式、對焦模式均設置為自動模式）。為保證現場采集角膜圖像的真實性和準確性，死后角膜圖像采集系統由智能手機及附件部分組成，附件包括帶有光源的泡沫圓筒及移動電源。泡沫圓筒高6.0 cm，屬于微距拍攝的最理想高度范圍［14-15］，以便采集角膜圖像細節特征。筒頂部正中視窗剛好容納智能手機攝像頭，圖像采集時角膜位于視窗下方正中央，保證了圖像都在同一曝光條件、同一高度及角度下獲得。圓筒內部頂端環形LED燈管較線形燈管更能保證覆蓋眼表的光線強度均勻，避免于背光側形成陰影導致圖像差異。研究發現，該系統攜帶方便、操作簡單，攝取數字圖像的像素也符合分析要求，適用于現場實時動態采集個體死后角膜數字圖像。

本研究發現，兔死后72 h內，反映角膜瞳孔區域圖像變化的顏色特征參數R、G、B與PMI呈顯著相關（P＜ 0.01或P＜ 0.05），其中R與PMI相關性最高（R2=0.935）；H、S、V參數值與PMI的關系均無統計學意義（P＞ 0.05）。分析其原因，一方面，實驗用兔的角膜本身無色透明，但因眼底視網膜血管透過瞳孔反映在角膜上而呈淡紅色。故在用數字圖像顏色特征提取量化分析角膜混濁過程所致角膜瞳孔區域圖像顏色變化時，反映出R指標較其他指標更為敏感，R值與PMI更具相關性；另一方面，由于兔角膜本身無色，死后角膜數字圖像顏色的色調、飽和度、明度變化表達不明顯，加之HSV顏色模型側重于色彩表示，并不適于無彩色系類（黑、白、灰）的表達［16-18］，故H、S、V與PMI相關性較低。本研究還發現，相同條件下的個體內及個體間R數值差異無統計學意義（P＞ 0.05），表明R指標適合動態評價死后角膜圖像顏色變化以推斷PMI。

本研究還對不同環境條件下應用該方法推斷PMI的可行性進行了驗證實驗，結果表明，尸體所處溫、濕度條件的變化會導致PMI推斷預測誤差范圍加大。分析其原因，可能是角膜混濁的發生與角膜內皮細胞的退化和角膜水分的蒸發有關，當尸體所處環境的溫度、濕度發生變化時，會影響角膜混濁變化的進程［19-21］。而驗證實驗中均采用在預先固定的環境條件下獲得的回歸方程推斷PMI，故當溫、濕度升高時，該方法推斷的PMI準確性會有所下降。提示法醫學實踐中利用死后角膜混濁變化推斷PMI還應考慮尸體所處環境的影響。

綜上所述，本研究組設計的便攜式“個體死后角膜圖像采集系統”結合數字圖像處理技術，為現場采集角膜圖像并推斷PMI提供了一種客觀的新方法。今后將進一步完善手機移動端的智能化設計，在角膜圖像自動識別、人機交互界面開發、功能拓展等方面積極探索，以促進實現數字信息技術與傳統法醫學現場勘查、尸體檢驗等的深度融合。今后將繼續豐富實驗動物樣本，探索不同環境溫度、濕度條件下的死后角膜顏色變化的規律性，同時對尸體角膜圖像進行采集與分析，積累數據，以期實現依據尸體角膜圖像顏色變化分析推斷PMI。