新抑癌基因INPP4B在EB病毒相關(guān)胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

馬藝文，譚繼超，張宇，代偉宏，張瑜，林榮錦，羅陽，徐巖

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸腫瘤外科，沈陽 110001；2.寶雞市中心醫(yī)院乳腺科，陜西 寶雞 721008；3.中國醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)基因組學(xué)教研室，沈陽 110122）

磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyinositol 3-kinase，PI3K）/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是膜受體信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，在維持細(xì)胞生存和抑制細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。PI3K活化而產(chǎn)生的類脂產(chǎn)物3，4-二磷酸磷脂酰肌醇［PI（3，4）P2］和3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇［PI（3，4，5）P3］作為第二信使，通過磷酸化激活A(yù)kt蛋白，調(diào)節(jié)多個下游靶蛋白，如Caspase9，核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB），GSK3等，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制凋亡。PI3K/Akt信號通路異常活化，是腫瘤細(xì)胞的重要特征之一。這往往是由于PI3K/Akt信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子功能失活造成的。重要的抑癌基因PTEN就是PI3K/Akt信號通路中重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子［1］。INPP4B基因也在抑制PI3K/Akt信號通路方面發(fā)揮重要的作用，但其在胃癌中的功能尚不清楚。EB病毒相關(guān)胃癌是腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在EB病毒感染的一類胃癌，約占胃癌總數(shù)6%～15%［2］。雖然，PIK3CA突變以及DNA超甲基化等是EB病毒相關(guān)胃癌的分子生物學(xué)特征，但人們對EB病毒相關(guān)胃癌的認(rèn)識才剛剛開始。本研究擬通過檢測INPP4B蛋白在胃癌中的表達(dá)情況，來探討INPP4B與EB病毒相關(guān)胃癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)收集2001年3月至2007年7月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸腫瘤外科手術(shù)治療且病理資料完整的301例胃癌患者的石蠟包埋標(biāo)本，并選取對應(yīng)癌旁黏膜組織（距腫瘤邊緣 ＞ 5 cm）作為正常對照。其中，男214例，女87例，年齡29～81歲（平均50.2歲），所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。標(biāo)本收集均經(jīng)患者知情同意，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。免疫組化一抗為兔抗人INPP4B單克隆抗體（英國Abcam公司）；二抗為SABC-POD兔二抗試劑盒（博士德公司）、DAB顯色試劑盒（美國Boster公司）；用于EB病毒檢測的EBER原位雜交探針、原位雜交試劑盒及封片劑（丹麥Dako公司）。

1.2 方法

1.2.1 病理組織學(xué)檢查：石蠟包埋標(biāo)本常規(guī)行4 μm切片，一張用于HE染色，進(jìn)行病理學(xué)診斷。其余用于免疫組化染色和原位雜交實驗。按照日本胃癌處理規(guī)約的標(biāo)準(zhǔn)判定病灶的分化程度和組織分型等，浸潤深度和腫瘤分期的判定則依據(jù)2010年第八版TNM分期系統(tǒng)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色：采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素法，染色步驟按說明書進(jìn)行。常規(guī)脫蠟，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，以及抗原修復(fù)。以5%BSA室溫封閉后，一抗（1∶50）4 ℃過夜。二抗常溫孵育20 min，DAB顯色處理，蘇木素復(fù)染，脫水封片。用PBS代替一抗，作為空白對照。正常的胃黏膜腺體均為INPP4B蛋白陽性表達(dá)，所以將其作為陽性對照。通過與相鄰的正常胃腺體細(xì)胞相比較，來確定胃癌細(xì)胞中INPP4B的表達(dá)情況。以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞，每例隨機(jī)觀察10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。陽性染色按照其強(qiáng)度分為+、++、+++。分析結(jié)果時，陽性定義為至少≥10%的腫瘤細(xì)胞呈+～ +++染色。最終根據(jù)癌細(xì)胞中INPP4B蛋白表達(dá)與其癌旁正常細(xì)胞對比情況，將癌細(xì)胞分為2組：表達(dá)下降組、正常表達(dá)或升高組。

1.2.3 EBER原位雜交：石蠟切片水化，蛋白酶K預(yù)處理，探針雜交55 ℃孵育1 h 30 min，55 ℃洗脫25 min，孵育抗體20 min后封片。以熒光素鏈接的核酸肽鏈探針為陽性對照，以熒光素鏈接的隨機(jī)核酸肽鏈探針為陰性對照。根據(jù)染色結(jié)果分為EB病毒感染陽性及陰性2組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，不同臨床病理特征之間INPP4B蛋白表達(dá)比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法分析差異性，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中INPP4B蛋白的表達(dá)情況

正常胃黏膜細(xì)胞中均有INPP4B蛋白的表達(dá)，尤其在腺體頸部和底部。而與其相對應(yīng)的胃癌細(xì)胞中，INPP4B蛋白的表達(dá)則顯著下降。本研究檢測的301例胃癌標(biāo)本中，有146例（48.5%）出現(xiàn)了INPP4B蛋白表達(dá)明顯下降或陰性表達(dá)，見圖1。

2.2 INPP4B蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

INPP4B蛋白表達(dá)與患者的性別、年齡、主癌位置、大體分型、浸潤深度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及淋巴管癌栓等無關(guān)，而與腫瘤細(xì)胞的分化程度及生長方式則密切相關(guān)（P＜ 0.05）。低分化的胃癌細(xì)胞中INPP4B蛋白低表達(dá)的比例顯著高于高中分化的胃癌細(xì)胞。與巢狀及團(tuán)塊生長的胃癌組織相比，INPP4B在彌漫生長的胃癌組織中，更容易出現(xiàn)表達(dá)下降。見表1。

圖1 免疫組化檢測胃癌細(xì)胞中INPP4B蛋白表達(dá)Fig.1 Immunohistochemical result of INPP4B protein in gastric cancer

2.3 胃癌中EB病毒的感染狀態(tài)

原位雜交探針檢測腫瘤組織中的EB病毒EBER核酸分子，陽性信號定位于細(xì)胞核中，為深紫藍(lán)色，染色較濃且均勻。在本研究檢測的272例胃癌組織中，EB病毒感染的陽性比例為14.71%，見圖2。

表1 INPP4B表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Correlation between clinical characteristics and INPP4B expression in patients with gastric cancer

2.4 胃癌中EB病毒感染與INPP4B蛋白表達(dá)的相關(guān)性

圖2 胃癌組織中EB病毒原位雜交檢測結(jié)果Fig.2 EBRB in situ hybridization for EB virus in gastric cancer

本研究分析了免疫組化檢測的胃癌組織樣本中有193例同樣應(yīng)用于原位雜交檢測。提示INPP4B蛋白在胃癌組織中的表達(dá)降低與EB病毒感染顯著相關(guān)（P＜ 0.05）。見表2。

3 討論

多磷酸肌醇-4-磷酸酶Ⅱ型是不依賴Mg+的磷酸酶，可以使PI3K活化而產(chǎn)生的第二信使PI（3，4）P2，水解成PI（3）P，從而中斷PI3K/Akt信號繼續(xù)向下傳導(dǎo)。由于INPP4B對PI3K/Akt信號通路具有顯著調(diào)控作用，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖，目前認(rèn)為INPP4B很可能是一個重要的抑癌基因［3］。研究表明，在乳腺癌［4］、結(jié)直腸癌［5］、前列腺癌［6］等惡性腫瘤中，INPP4B均有較高頻率的表達(dá)下降，而且與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，尤其在轉(zhuǎn)移性腫瘤中下降的程度更加明顯。另外，研究［7］證實INPP4B的丟失可以異常增強(qiáng)PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)甲狀腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。但是，INPP4B在胃癌中的表達(dá)情況尚不清楚。本研究利用免疫組化檢測了301例胃癌組織中INPP4B蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在48.5%的胃癌組織中，出現(xiàn)了INPP4B蛋白表達(dá)下降。雖然INPP4B在低分化的胃癌中下降的頻率更高，但其表達(dá)水平與腫瘤的分期和預(yù)后未見統(tǒng)計學(xué)差異。

表2 胃癌中INPP4B蛋白表達(dá)與EB病毒感染的相關(guān)性Tab.2 Correlation between INPP4B expression and EB virus infection in GC

進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，INPP4B蛋白表達(dá)下降與EB病毒感染陽性密切相關(guān)（P＜ 0.05）。EB病毒相關(guān)胃癌是一類特殊的胃癌類型，具有其獨(dú)特的分子生物學(xué)特征及發(fā)病機(jī)制。2014年，美國癌癥基因組圖譜協(xié)作組根據(jù)細(xì)胞的分子生物學(xué)特點［8］將胃癌分為4種亞型：EB病毒感染陽性型，微衛(wèi)星不穩(wěn)定型，基因組穩(wěn)定型以及染色體不穩(wěn)定型。這4種胃癌亞型在流行病學(xué)、臨床病理特征、分子表型及預(yù)后方面均有統(tǒng)計學(xué)差異。其中，EB病毒感染陽性型胃癌，以更廣泛的DNA超甲基化，PIK3CA突變，PD-L1/2過表達(dá)，CDKN2A基因沉默等為主要特征。

值得注意的是，作為抑癌基因的INPP4B，啟動子區(qū)域的超甲基化很可能是其失活的分子機(jī)制。有研究［9］發(fā)現(xiàn)，在被EB病毒感染的喉癌組織中，INPP4B啟動子區(qū)域的超甲基化與INPP4B蛋白的表達(dá)下降密切相關(guān)。而且INPP4B的丟失持續(xù)增強(qiáng)PI3K/Akt信號，從而促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展。EB病毒的潛伏膜蛋白1可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的甲基轉(zhuǎn)移酶，從而改變宿主基因組的甲基化狀態(tài)［10］。由EB病毒導(dǎo)致的基因組超甲基化狀態(tài)，也可以導(dǎo)致某些抑癌基因的失活，進(jìn)而引起宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［11］。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)了INPP4B蛋白在胃癌組織中存在高頻率的表達(dá)下降，而且INPP4B的表達(dá)下降與EB病毒感染密切相關(guān)。進(jìn)一步研究INPP4B失活的具體機(jī)制將為揭示EB病毒相關(guān)胃癌的發(fā)病機(jī)制提供更深入的理論依據(jù)。