一例雞源金黃色葡萄球菌的分離鑒定與耐藥性分析

趙鶴庭，嚴紅亞，何輝，羅文華，字吉祥，常志順*，信愛國*

(1.云南省畜牧獸醫科學院 養禽與禽病研究所,云南 昆明 650224；2.洱源縣動物疫病預防控制中心,云南 洱源 671200； 3.蒙自市文瀾鎮畜牧獸醫站，云南 蒙自 661100； 4.云南農業大學動物醫學院，云南 昆明 650201)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)是一種常見的需氧或兼性厭氧革蘭氏陽性條件性病原菌，廣泛存在于環境中、健康動物及家禽的皮膚和羽毛上。雞感染金黃色葡萄球菌臨床大多表現出化膿性關節炎、皮炎、骨膜炎等特征，有些雞群感染后臨床特征不明顯。近年來，禽葡萄球菌病的發生有上升的趨勢[1、2]。 流行病學調查顯示，金黃色葡萄球菌能夠感染從雞胚到成年雞各個階段的雞群，造成雞關節炎、癱瘓甚至死亡[3]。 在雨季和潮濕季節發病較多，尤以8—11月為高發期，發病率與死亡率因雞群的飼養管理狀況、環境條件及治療措施是否得當而有較大差異[4、5]。本文對2019 年2月送檢的臨床疑似葡萄球菌感染的蛋雞通過臨床癥狀和病理剖檢，采集組織樣品進行細菌分離鑒定，確診為致病性金黃色葡萄球菌感染。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2019年2月，云南某養雞場送檢蛋雞，發病雞群主要表現為產蛋率下降，食欲減退至廢絕，跛行。通過解剖、采集樣品進行細菌分離鑒定。

1.2 主要試劑

細菌總DNA提取試劑盒、DNA marker DL2000購自天根生物科技(北京)有限公司； 2×EasyPfu PCR SuperMix試劑購自北京全式金生物技術有限公司。普通營養瓊脂和血瓊脂培養基等按常規法制備；抗生素藥敏紙片、革蘭氏染液、細菌微量生化反應管購自(杭州)天和微生物試劑有限公司。

1.3 細菌分離鑒定

病死雞解剖后，接種環無菌采集肝臟、骨髓等病變器官涂布于血瓊脂和普通營養瓊脂平板，37℃恒溫培養16～24h后，挑取單菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察細菌形態。對分離菌株進行單菌落劃線培養純化后，對分離菌株進行生理生化鑒定[6]。

1.4 分離菌的PCR鑒定

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取分離菌基因組DNA。根據細菌16S rDNA 鑒定菌株的標準操作規程，將細菌16S rDNA分成3段首尾重疊片段進行擴增，片段1(引物對16S-27F /16S-519R)預計擴增片段500bp，片段2(引物對16S-357F /16S-1115R)預計擴增片段750bp，片段3(引物對16S-926F /16S-1492R)預計擴增片段560 bp。根據金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc合成引物 nucF/nucR[7]，預計擴增 478bp 片段。引物序列見表 1，由昆明碩擎生物有限公司合成。 PCR反應體系為25μL，反應條件為：94℃預變性3min；94℃變性30s，55℃時退火30s，72℃延伸45s，35個循環；最后72℃延伸7min；4℃保存。取5μL擴增產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析儀觀察結果。16S rDNA的3個擴增片段送測序，采用Vecter NTI 軟件拼接，得到大約1500bp的細菌16S rDNA序列。將序列提交GenBank進行Blast比對，確定細菌的種屬分類。

表1 PCR 擴增引物序列信息表

2 結果

2.1 剖檢變化

胸、腿部皮下出血；關節腫脹，按壓有波動感，關節囊內有漿液性滲出物(圖1)；部分病禽股骨頭壞死(圖2)。

圖1 關節炎性滲出

圖2 股骨頭壞死

2.2 分離菌形態特征及生化試驗結果

通過細菌分離及單菌落純化，得到的細菌在普通瓊脂平板上形成表面光滑、濕潤、隆起的卵圓形菌落，初期呈灰白色，繼而菌落逐漸變為金黃色(圖3)。菌株在血瓊脂平板上形成較大菌落，在菌落周圍產生明顯的β溶血(圖4)。革蘭氏染色呈現藍紫色，無芽孢、葡萄狀菌落(圖5)。分離菌發酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、丙酮酸，產酸；凝固酶、耐熱核酸酶、透明質酸酶陽性；分離菌符合葡萄球菌屬的生化培養特征，初步判斷為金黃色葡萄球菌。

圖3 分離菌在普通瓊脂平板上的形態

圖 4 分離菌在血瓊脂平板上形成β溶血

圖5 分離細菌革蘭氏染色結果

2.3 分離菌株PCR檢測及16S rDNA擴增結果

提取分離菌株基因組DNA，用引物對nucF/nucR檢測金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因，結果獲得預期478bp片段，對照沙門菌和大腸桿菌未見擴增產物(圖6)。分離菌16S rDNA分3段擴增，分別獲得預期的500bp、750bp和560bp 擴增產物(圖7)，PCR產物凝膠純化后，進行雙向測序。

M：分子量標準DL2000；1：金黃色葡萄球菌nuc基因檢測結果；2：禽沙門菌對照；3：大腸桿菌對照

圖6金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因檢測結果

M：分子量標準DL2000；1-3：分離菌16S rDNA片段1、2和片段3擴增產物

圖7分離菌16Sr DNA 3個片段的PCR擴增結果

2.4 分離菌16S rDNA序列比對鑒定與分類結果

利用Vector NTI 軟件將上述3個片段核酸序列拼接，獲得分離菌株16S rDNA核酸序列1495bp。將分離菌16S rDNA核酸序列提交GenBank數據庫進行Blast比對分析，結果顯示分離菌株屬于金黃色葡萄球菌。

2.5 藥物敏感性試驗結果

對17種藥物的敏感性試驗結果顯示，分離菌株對頭孢氨芐、恩諾沙星、妥布霉素、頭孢他啶、慶大霉素、左氟沙星和卡那霉素敏感，對環丙沙星、新霉素和阿米卡星等3種藥物中度敏感，對阿莫西林、四環素、青霉素G、氯霉素、復方新諾明和氨芐西林具有耐藥性(見表2)。

表2 藥敏試驗結果

注：S：敏感；R：耐藥；I：中度敏感

3 討論

金黃色葡萄球菌感染是導致人及多種動物皮膚與軟組織感染、壞死性肺炎、敗血性關節炎、血管內感染、心內膜炎的病原之一[8]，是一種重要的人畜共患性病原菌。主要導致感染家禽“跛足病”、臍炎等臨床癥狀，對養禽業危害嚴重。本研究從云南蛋雞中分離出金黃色葡萄球菌，提示該菌在產蛋雞群中存在，科學防治金黃色葡萄球菌感染對保障動物源性食品安全具有重要的獸醫公共衛生意義。

對雞葡萄球菌病的診斷，根據臨床病理剖檢和鏡檢到葡萄串狀的球菌不足以確診，需要通過細菌分離、生化試驗及PCR等進行確診。本研究測定了分離菌的16S rDNA核酸序列，進行比對確定分離菌的種屬分類。16S rDNA序列具有細菌屬、種的特征，作為新的分子分類技術方法，已成為細菌分類和鑒定的新方法。此外，由于葡萄球菌容易產生耐藥性，臨床上金黃色葡萄球菌多重耐藥菌株大量出現。 本次分離菌株對阿莫西林、四環素、青霉素、氯霉素、復方新諾明和氨芐西林具有明顯耐藥性，分離結果對該病防治具有重要的臨床指導意義。

金黃色葡萄球菌大量存在于自然環境中，特別是禽舍糞便中的金黃色葡萄球菌可產生氣溶膠，通過禽舍間的通風裝置互相傳播，對周圍空氣造成污染[9]。因此，養殖場應加強飼養管理，嚴格執行生物安全防控措施，做好養殖場的清潔衛生和消毒工作，盡量減少各種應激因素；一旦發現雞群有外傷時，要及時進行處理，減少疾病傳播；嚴格淘汰感染動物等綜合技術手段。國內有報道在20～25日齡接種禽葡萄球菌油乳劑苗和氫氧化鋁菌苗進行免疫預防[8]，對云南蛋雞場防控禽葡萄球菌感染具有借鑒意義。