大鼠脊髓背角膠狀質神經元去極化反跳參與大鼠慢性神經病理性疼痛*

李凌超 朱夢葉 吳艷盈 張達穎

（1大連醫科大學附屬第二醫院疼痛科，大連 116000；2南昌大學第一附屬醫院疼痛科，南昌 330006；3大連花園口新城醫院內科，大連 116000）

慢性疼痛被定義為持續或復發的時間超過1個月的疼痛[1]。慢性疼痛不僅影響工作及生活質量，還可能誘發焦慮、抑郁等負面情緒，給家庭和社會帶來沉重的負擔。調查顯示：我國慢性疼痛的發病率為52.99%[2]，而且隨年齡的增長而增加，50%～75%的老年人存在一種或多種慢性疼痛[3]。慢性疼痛的發病率高，其病理生理機制尚未完全明確，臨床治療效果不佳。

神經元在接受超極化刺激后爆發動作電位的現象叫做“去極化反跳(rebound depolarization)”[4,5]。有研究發現，去極化反跳在生理和病理狀態下都發揮作用[6,7]，而且發生部位不同其功能也不同。去極化反跳還可能與抑制性和興奮性信息之間的轉換以及與外周刺激強度識別相關[8～10]。

脊髓背角II層被稱為膠狀質(substantia gelatinosa, SG)區，是痛覺信號由外周傳入中樞的第一個中繼站[11]，在痛覺傳遞與調制中起到關鍵的作用。Rivera-Arconada等人對脊髓背角IV、V、VI層神經元的去極化反跳進行了研究[10]，但II層SG神經元在慢性疼痛狀態下的去極化反跳特點尚無報道，因此，本研究制作坐骨神經部分結扎(partial sciatic nerve ligation, PSNL)模型，結合膜片鉗電生理技術，初步探討離體脊髓切片中SG神經元去極化反跳的基本特點，為明確慢性疼痛的脊髓機理以及發現慢性疼痛治療的新靶點提供理論依據。

方 法

1.實驗動物

選取4周齡雄性SD大鼠66只，體重為90 ～ 100 g，采用隨機數字表法隨機分為3組：模型組模型組（坐骨神經部分結扎，PSNL）、假手術組(sham)和對照組(control)，每組各22只。模型組行坐骨神經部分結扎(partial sciatic nerve ligation,PSNL)，假手術組不縫扎神經，余步驟同模型組，對照組不做任何處理。本實驗中所有大鼠均來源于江西中醫藥大學動物實驗中心，本研究嚴格按照《南昌大學動物實驗倫理審查》原則和《南昌大學實驗動物管理辦法》進行。

2.實驗相關溶液配制

（1）解剖液組成成分為(mmol/L)：sucrose 240，NaHCO325，KCl 2.5，NaH2PO4·2H2O 1.25，CaCl2·2H2O 0.5，MgCl2·6H2O 3.5，ascorbic acid 0.4，sodium pyruvate 2 (pH=7.4, 310 mOsm)。

（2）人工腦脊液(ACSF)組成成分為(mmol/L)：NaCl 117，KCl 3.6，NaH2PO4·2H2O 1.2，CaCl2·2H2O 2.5，MgCl2·6H2O 1.2，NaHCO325，glucose 11，ascorbic acid 0.4，sodium pyruvate 2 (pH=7.4,310 mOsm)。

（3）電極內液成份為(mmol/L)：K-gluconate 130，KCl 5，EGTA 0.5，HEPES 10，Mg-ATP 4，Li-GTP 0.3，phosphocreatine di (tris) salt 10 (pH=7.2,300 mOsm)。K-gluconate購自Wako，余試劑均購自Sigma。

3.實驗方法

參照Seltzer等[12]的方法，制作坐骨神經部分結扎(PSNL)模型：取 4周齡雄性 SD 大鼠，乙醚麻醉后，無菌操作下在右側股段高位切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經，將7-0尼龍絲線縫入神經干內，使神經的背側1/3～1/2被收在線圈內，然后較松結扎套在線圈內的部分神經干，逐層縫合至皮膚。假手術組不縫扎神經，其他步驟和模型組相同，對照組不做任何處理。應用Von Frey觸覺測痛儀，采用 Dixon 的Up and down方法[13]測量模型組和假手術組術前、術后3、7、10和14 d以及對照組相應時間點的機械痛閾，克數遞增或遞減的方式進行測試，每次測試重復10次，持續時間6 ～ 8 s，每兩次測試間隔超過15 s，若10次中出現縮爪或舔爪反應≥5次被認為陽性，并記錄出現陽性反應的最小克數作為其縮爪閾值。

模型組和假手術組均于術后15 d制作離體脊髓切片后處死，對照組同期制作脊髓切片。腹腔注射烏拉坦（每公斤體重1.2 g），行心臟灌流，剪下并取出以腰骶膨大為中心的脊髓，用振動切片機在冰水混合狀態下的解剖液中切取300 μm厚的脊髓縱切片。將切好的脊髓切片轉入32 ℃恒溫并持續充氧(95% O2+ 5% CO2)的人工腦脊液中孵育半個小時，目的為盡可能模擬SG神經元正常的生理環境。獲取所需標本后，采用放血法處死仍在麻醉狀態下的實驗動物。

應用全細胞膜片鉗技術記錄模型組、假手術組和對照組SG神經元(n=34)的去極化反跳反應及其他電生理特性。把孵育后的脊髓縱切片移到電生理記錄槽內，表面持續恒速灌流充以95% O2和5% CO2混合氣體的人工腦脊液。參照我們以前的方法[14]，首先在顯微鏡低倍鏡(BX51WI, Olympus)，10倍下找到半透明的脊髓背角SG區（見圖1A），然后換用高倍紅外微分干涉相差鏡(IR-1000, Dage-MIT)40倍，選取狀態良好的神經元（表現為細胞立體感強，胞膜較為清晰，富有彈性）進行全細胞膜片鉗記錄（見圖1B）。通過調節顯微鏡粗調和微操控系統，使電極尖端和神經元細胞膜緊密連接，然后將鉗制電位(holding potential, HP)控制在-70 mV，破膜，形成全細胞膜片鉗(whole cell patch clamp)記錄模式。所有實驗結果的記錄均在封接5 ～ 10 min電流穩定之后進行。給予時程1 s，大小 -120 pA的超極化電流刺激，可觀察到細胞受超極化刺激（見圖1C紫色框內部分）后產生的去極化反應（見圖1CE黑色箭頭所指）。根據有或無去極化反跳及是否伴有放電，將SG神經元分為三組：無去極化反跳（見圖1C）、去極化反跳無放電（見圖1D）和去極化反跳伴放電（見圖1E），后兩者歸納為有去極化反跳。本實驗應用EPC-10放大器（HEKA公司生產）進行細胞電信號的采集并使用Patchmaster軟件進行記錄和分析，整個記錄過程在室溫下進行。

4.統計學分析

所有數據均以均數±標準誤()表示。各組數據采用GraphPad Prism 5.0進行曲線擬合。采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。多組樣本差異比較采用方差分析；重復測量數據采用重復測量方差分析；計數資料采用卡方檢驗。P?0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1.大鼠疼痛行為學

模型組(n= 22)術后3天機械痛閾(3.1±0.3 g)相比假手術組(3.7±0.3 g)和對照組(3.8±0.3 g)有下降趨勢，但無統計學意義；模型組術后7天(2.1±0.2 g)、10天(1.7±0.2 g)、14天(1.5±0.2 g)機械痛閾比假手術組 (3.9±0.3 g)、(3.7±0.3 g)、(4.0±0.3 g)和對照組 (3.9±0.2 g)、(3.7±0.3 g)、(3.8±0.3 g)顯著降低（P?0.05，見圖2）。

2.PSNL術后SG神經元去極化反跳現象增加

圖1 SG神經元在顯微鏡下的形態及接受超極化電流刺激后反應代表圖Fig.1 The representative diagram of morphology under microscope and the response after hyperpolarizing current stimulation of SG neurons

本實驗共記錄102個SG神經元的電生理記錄，模型組、假手術組和對照組每組均記錄了34個，每組中有去極化反跳的神經元數分別為26、19和17。SG神經元中50%以上有去極化反跳，而且模型組去極化反跳的出現概率明顯高于假手術組和對照組（P?0.05，見圖3）。

3.PSNL術后SG神經元電生理特性的變化

模型組(n= 34)、假手術組(n= 34)和對照組(n= 34)神經元的電生理特點（見表1）：模型組SG神經元的動作電位閾值(-36.0±2.0 mV)明顯低于假手術組(-29.1±1.0 mV)和對照組(-28.7±1.6 mV) (P?0.05)，而輸入阻抗 (966.0±119.0 Ω)明顯高于假手術組(632.0±58.0 Ω)和對照組(636.0±91.0 Ω) (P?0.05)。

另外，給予SG神經元0 pA至150 pA階躍式電流刺激，在110 pA、120 pA、130 pA、140 pA和150 pA刺激過程中，PSNL組(n= 34)動作電位頻率分別為 21.3±2.5 Hz，22.2±2.6 Hz，23.0±2.8 Hz，23.6±3.0 Hz，24.5±3.2 Hz，假手術組(n= 34)分別為 18.7±1.7 Hz，19.4±1.8 Hz，19.7±2.0 Hz ，20.5±2.0 Hz，21.0±2.2 Hz，對照組(n= 34)分別為18.6±1.7 Hz，19.4±1.8 Hz，19.7±2.0 Hz，20.5±2.1 Hz，21.0±2.2 Hz，PSNL組動作電位頻率明顯高于假手術組和對照組（P?0.05，見圖4）。

圖2 模型組術后3、7、10、14天機械痛閾(EM)Fig.2 Comparison of the mechanical threshold on 3, 7, 10 and 14 days after operation among the model group(EM)

討 論

當正離子由膜內向膜外轉運（如腺苷A1受體激活后引起的鉀離子外流[15]）或負離子由膜外向膜內轉運（如甘氨酸和γ氨基丁酸受體激活后引起的氯離子內流[16]）時，這種外向電流可使膜電位增大，發生超極化。去極化反跳是神經元細胞膜在接受超極化刺激后出現的短暫去極化現象，部分神經元在該去極化的基礎上可爆發動作電位[17,18]。去極化反跳多見于具有自發性節律發放的神經元，如丘腦皮層神經元[19]，此外還見于無自發性節律發放的神經元，如內膝體神經元[20]和脊髓背角深層神經元[10]等。很多區域的神經元在接受超極化刺激后，都可形成去極化反跳，也就是說可將抑制性的信號輸入轉化為興奮性的信號輸出[21]。

來自Aδ及C纖維傳入的外周傷害性信息由SG區神經元初步整合，再經過脊髓丘腦束等上行通路進入中樞神經系統高級部位，另外，SG區還匯聚來自腦干和大腦皮質的下行抑制性投射神經纖維，這些上行與下行系統以及局部的中間神經元共同構成了復雜的神經網絡，這是“閘門控制理論”的核心[22]。本研究發現超過1/2的脊髓背角SG神經元可記錄到去極化反跳現象。Yasaka等發現SD大鼠具有去極化反跳的SG神經元約占所記錄神經元的30%～ 40%[23]，而在幼年C57Bl/6小鼠的背角淺層神經元中，該比例不到30%[24]，均低于本研究中的比例，表明不同種屬或不同部位的神經元，去極化反跳也不完全相同[25]。

圖3 模型組SG神經元去極化反跳出現的概率(EM)Fig.3 Comparison of the probability of SG neurons depolarization rebound among the model group (EM)

表1 模型組、假手術組和對照組SG神經元的基本電生理特性比較(n=34,EM)Table 1 Comparison of basic electrophysiological characteristics of SG neurons in the PSNL group, the sham operation group,and the control group (n=34,EM)

表1 模型組、假手術組和對照組SG神經元的基本電生理特性比較(n=34,EM)Table 1 Comparison of basic electrophysiological characteristics of SG neurons in the PSNL group, the sham operation group,and the control group (n=34,EM)

RMP為靜息電位；Cm為膜電容；AP-T為動作電位閾值；AP-A為動作電位振幅；AP-HF為動作電位半寬度；Rin為輸入阻抗。 *P?0.05，模型組和假手術組比較，#P?0.05，模型組和對照組比較RMP: Resting membrane potential; Cm: Membrane capacitance; AP-T: Threshold of action potential; AP-A: Amplitude of action potential; APHF: Half width of action potential; Rin: Input impedance.*P?0.05, compared with the sham operation group; #P?0.05, compared with the control group.

對照組Control RMP (mV) -53.5±0.8 -55.3±1.6 -52.8±1.0 -52.1±1.5 Cm (pF) 61.2±7.2 53.2±5.1 56.5±4.9 74.2±2.8 AP-T (mV) -31.6±1.0 -36.0±2.0*# -29.1±1.0 -28.7±1.6 AP-A (mV) 71.7±1.7 66.9±2.3 72.6±1.6 76.3±4.1 AP-HF (ms) 1.2±0.1 1.5±0.2 1.0±0.1 1.0±0.1 Rin (Ω) 762.0±100.0 966.0±119.0*# 632.0±58.0 636.0±91.0總數Total模型組PSNL假手術組Sham

圖4 模型組SG神經元動作電位頻率(EM)Fig.4 Comparison of the action potential frequency of SG neurons among the model group (EM)

通常情況下，動作電位閾值越低越容易發生去極化，神經元興奮性就越高。本研究發現，反跳并放電組神經元的動作電位閾值比無反跳組低。PSNL組SG神經元的輸入阻抗(Rin)明顯高于假手術組，在給予相同的電流刺激時輸入阻抗大的神經元會產生更高的電壓，會更接近于動作電位閾值，更容易產生動作電位，神經元的興奮性也就越高。

PSNL模型是經典的神經病理性疼痛模型之一，可導致出現長達7個月的機械痛敏、熱痛敏和自發性疼痛。王英偉等人研究發現，6 ～ 8周齡的SD大鼠PSNL模型組術后3～28 d時機械痛閾和熱痛閾降低[26]，而在本研究中，PNSL術后3天手術側機械痛閾與假手術組比較，但無統計學意義，可能由于不同周齡的大鼠其行為學特點也有所不同。

本研究通過建立大鼠坐骨神經部分結扎模型，對各組離體脊髓切片的SG神經元進行全細胞膜片鉗記錄，探討了慢性疼痛狀態下SG神經元的基本電生理特性以及其去極化反跳的表達情況，進一步闡述了調控疼痛的脊髓機理，為臨床治療慢性疼痛的藥物研發提供了理論依據。