皮層擴布性抑制與偏頭痛的相關研究進展*

楊夢麗 唐聞晶 于生元

（中國人民解放軍總醫院神經內科，北京 100853）

偏頭痛是一種發病率很高的原發性頭痛[1]。根據最新的全球疾病負擔研究顯示，在50歲以下的人群中偏頭痛已躍居致失能性疾病排行榜第一位，嚴重影響人們的工作和生活[2]。偏頭痛的病理生理學機制尚不清楚，一般認為皮層擴布性抑制(cortical spreading depression, CSD)與偏頭痛先兆癥狀相關[3]。CSD是發生在神經元和神經膠質細胞上的一種緩慢傳播的去極化波，速率約為2～5 mm/min，持續約1 min左右，隨后導致數分鐘的腦電活動抑制[4]。雖然普遍認為CSD與偏頭痛相關，由于相關技術手段的限制，缺少CSD與偏頭痛關系的直接證據，CSD是否可以直接引起偏頭痛的發作仍不明了。本文將總結CSD的相關特征及最新研究進展，進一步探索CSD與偏頭痛的關系，深化偏頭痛機制的研究，也為偏頭痛進一步的研究和治療提供新的思路。

一、CSD的離子、分子機制

CSD的發生被認為與離子濃度失衡有關，其潛在的機制可能與細胞內外離子濃度的快速變化相關，通常是由K+和H+的分泌以及Na+、Ca2+和Cl-的吸收所引起，包括K+的快速外流，Na+、 Ca2+、Cl-以及H+的快速內流，產生內向電流。細胞內Ca2+增加的同時，釋放到細胞間隙的K+和谷氨酸的濃度增加，興奮性抑制性失衡，進而改變了局部細胞的興奮性，引發正反饋循環，最終導致腦功能混亂引發偏頭痛（見表1）。而細胞內外K+的濃度變化被認為是引發皮層擴布性抑制的關鍵因素[5]。

二、CSD相關的血管及血流動力學改變

雖然早在1944年Leao就指出了CSD與偏頭痛先兆癥狀之間的相似性，但當時普遍認為偏頭痛先兆是由于血管痙攣和皮質缺血引起的。后來一系列針對偏頭痛發作期間區域腦血流量變化的研究表明，發作初始血管充血，隨后是長期的低灌注。這些觀察結果駁斥了缺血假說，也是偏頭痛的血管痙攣理論的終結。

后續的動物研究表明CSD與血管直徑的變化顯著相關，且與研究的準備工作及研究的動物種類有關。通過采用內源光信號(optical intrinsic signal,OIS)成像，可透過小鼠的顱骨觀察到CSD引起的多相血管反應，在CSD波擴布前可能存在血管的擴張，隨后出現與CSD波相關的血管顯著收縮，隨后血管恢復正常口徑或稍擴張狀態，然后再持續收縮，持續長達一個小時。在大鼠和其他物種中，血管的收縮可能不是如此顯著，并且擴張的時間可延長。且對小鼠的研究表明，硬腦膜和顱骨存在與否會對血管反應產生顯著差異，在有硬腦膜和顱骨覆蓋的地方會出現更加顯著的血管收縮[6]。在KCl誘導CSD的小鼠模型中，通過采用激光共聚焦熒光顯微鏡，發現CSD發生時伴隨著軟腦膜血管快速而顯著的收縮，隨后擴張，然后再持續收縮。且CSD誘導的區域腦血流量(regional cerebral blood flow, rCBF)增加時不僅伴隨著軟腦膜血管的擴張，皮層血管也參與rCBF的增加[7]。

表1 CSD發生時細胞內外的離子、分子濃度變化

目前的數據表明，血流動力學對CSD的反應在CSD波的不同階段由多個相反的血管運動組成，典型的CBF反應至少有四種不同的血管運動組成：①與直流電位變化(direct current，DC)轉變相一致的初始低灌注或血管收縮；②復極期間出現峰值充血或血管擴張，并在完全DC轉換恢復后達到最大值；③在CSD之后3～5 min發生較小的遲發性充血或血管擴張；④持續一小時或更長時間的SD后血流量減少或血管收縮。且多種因素可影響研究中血流動力學的反應，例如物種和品系的差異，同一物種不同個體間的差異，此外研究的大腦和血管區域的不同，采用的研究技術不同、顱骨或硬腦膜的存在與否、麻醉劑、手術方式、生理狀態等均會影響實驗結果,因此在進行CSD相關實驗時，實驗結果可能因各種條件的不同而產生差異。

三、CSD與偏頭痛之間的關系

從CSD發現至今，CSD的電生理特性與偏頭痛先兆癥狀之間的相似性，提示兩者之間存在因果關系，現有實驗證據間接證明CSD是偏頭痛先兆的發生機制，基礎和臨床研究強調，將CSD作為偏頭痛先兆的潛在電生理機制，認為它能夠激活三叉神經血管系統，誘發與頭痛發病相關的神經炎性級聯反應，進而引發頭痛。研究發現，CSD可引起神經元泛通道連接蛋白(pannexin 1, PANX1)通道的開放，高遷移率組蛋白-B1 (high-mobility group box 1, HMGB1)和白介素 -1β (interleukin-1 beta, IL-1β)釋放，接著激活星形膠質細胞的NF-κB (nuclear factor-kappa B)信號通路，誘導炎性酶類介質，如誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和環氧合酶2 (cyclooxygenase 2, COX2)等的高表達，觸發促炎因子，激活三叉神經血管系統。最近的動物實驗表明，PANX1在擴散去極化后迅速打開，通過與激活的嘌呤能P2X7受體緊密結合所形成的P2X7-PANX1孔隙復合體來介導谷氨酸鹽的釋放，這個過程與CSD生成的易感性相關。使用P2X7/PANX1孔隙復合體抑制劑或使P2X7的基因缺失，均能夠降低CSD的頻率并提高其閾值，從而抑制下游的炎癥反應和三叉神經血管系統的激活。這表明P2X7/PANX1復合體抑制劑在抑制擴散去極化啟動和傳播及延長擴散去極化后不應期方面的穩定性和重要性，也為偏頭痛的治療提供新的靶點[8]。

四、CSD相關模型的構建及誘導

關于CSD的實驗模型研究主要采用離體和在體兩種方式[9]。對于離體實驗主要采用細胞、腦片的方式來研究各種藥物對CSD性質的影響。離體模型可消除血液動力學、藥代動力學、麻醉相關和全身生理因素等條件的影響。然而，暴露于缺血缺氧條件下和實驗過程中的副損傷可能會混淆實驗結果，并且直接在體外超灌注很難判斷臨床相關的藥物濃度，不利于藥物的篩選。在體的動物模型主要在動物麻醉或者清醒狀態下進行，動物種類眾多，涉及嚙齒類動物、鴿子、猴、貓等，并且生理狀態下可以更好的了解CSD的相關特征及與偏頭痛之間的關系。

在實驗動物模型中CSD的誘導通常是將皮質直接暴露于去極化刺激，例如電刺激、化學刺激、局部機械刺激等。一般局部或腦實質內直接應用氯化鉀和直流電刺激是最可靠且最常用的誘導CSD的方法，可用以估計對SD的組織敏感性和篩選抗偏頭痛藥物。電刺激是誘導和評估CSD易感性最直接的方法之一，通過一定頻率的刺激強度和時間可誘發CSD的產生，而刺激的電極和電極接觸的組織特性會嚴重影響觸發CSD所需的刺激強度。有研究顯示以1 Hz和20 Hz的重復電刺激能明顯增加受刺激半球CSD的傳播速度，且與1 Hz的刺激相比，20 Hz刺激對CSD的產生作用更大，傳播速度更快，持續時間更長。

誘導CSD的產生及測定CSD易感性的最常見的化學方法是采用一定濃度的KCl溶液（通常濃度為50mM或更高），通常是在硬腦膜上或在皮層內局部應用KCl (0.5-1 M)，可用于多個CSD的誘導。此外，其他化學刺激，例如谷氨酸、谷氨酸受體激動劑、Ca2+通道開放劑或離子載體（例如Bay K8644）、 和鈉離子通道激活劑，例如烏頭堿和鈉鉀泵抑制劑哇巴音，均可誘導CSD的產生。通過逐步提高去極化劑的濃度或注射的體積來確定產生CSD的閾值；通過連續施加恒定的超閾值濃度（例如1M KCl）以觸發重復CSD的產生并確定其頻率。此外，KCl誘導CSD產生的閾值和頻率與顱骨窗直徑的大小和硬腦膜存在與否相關。因此，在進行CSD的實驗時，盡可能保證相一致的實驗條件和參數，將大大增加CSD結果的一致性和穩定性。

機械刺激也被用于CSD的誘導和易感性的評估，觸發CSD的一個基本的機械方法是快速的針刺皮層。針刺方法操作簡單，優點是可研究目標區域內的單一CSD波。然而，它不適用于重復CSD的產生，而且它不能測定CSD的閾值[10]。且重復性針刺誘導，可重現性差，其導致的累計性損傷也可影響CSD的特征。此外，與化學或電刺激誘導相比，機械刺激誘導的CSD似乎具有不同的藥理學特征。有研究表明在針刺誘導的CSD中觀察了不同的離子通道阻斷劑的反應，發現鈉離子通道阻滯劑能夠抑制CSD引起的貓和大鼠的rCBF變化，而電壓依賴性鈣通道阻斷劑和ATP激活的鉀離子通道的阻斷劑對CSD的產生和擴布幾乎沒有影響，表明鈉離子通道在機械刺激誘導的CSD所引起的rCBF變化中起主要作用。

不論是電刺激、機械刺激還是化學刺激誘導產生CSD均涉及侵入性方法，需要開顱手術聯合皮質暴露。雖然這些干預措施能夠使神經元去極化，但它們也對神經元、星形膠質細胞等產生非特異性潛在損傷效應，可能有助于CSD的發生。而光遺傳技術的出現可以更好的解決這一問題，通過采用相對非侵入性光遺傳的方法可特異性激活單個細胞類型，進行腦細胞活性的非侵入性體內調節，誘導CSD的產生，其時空精確性更高，且避免了可能由于電刺激、機械刺激或高濃度化學刺激造成的偽影和組織損傷[11]。

五、CSD的監測

CSD是神經元和神經膠質細胞的一種緩慢傳播的去極化波，隨后導致數分鐘的腦電活動的抑制。所以監測CSD最直接和標準的方法是電生理記錄，通過皮質內微電極記錄或者在硬腦膜或者顱骨外放置電極，可記錄到典型的負向緩慢的電位改變，并且可以測量計算去極化波的傳播速度、振幅及持續時間，同時記錄腦皮層電位可顯示腦電活動抑制情況。由于CSD發生的同時伴隨著顯著的rCBF和血管直徑的變化，因此可通過激光多普勒或激光散斑成像技術監測CSD的產生，產生的標準為與基線血流值相比血流變化大于20%即可認為CSD的產生。檢測CSD的一種替代方法是監測腦組織中光信號的變化。由于血紅蛋白濃度和含水量的改變腦組織的光吸收特性的改變。還有一種電壓敏感染料與激光散斑技術相結合的方法來研究去極化與相關血流變化之間的關系[11]。

六、清醒狀態下CSD相關的行為學表現

雖然普遍認為CSD與偏頭痛相關，是偏頭痛先兆癥狀的潛在病理生理學機制，但CSD是否引起與偏頭痛相關的頭痛仍缺少直接證據。而動物的行為學研究作為研究工具越來越重要，發現嚙齒類動物與頭痛行為相一致的行為學表現，將提高偏頭痛模型的可靠性。CSD是否能引發與頭痛相關的行為學表現呢？在一個局部應用N-甲基天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartic acid, NMDA)誘導CSD的研究中，通過評估動物行為學的表現，發現僵直行為(Freezing episodes)是最突出的行為變化，且是唯一的持續性行為改變。一項使用針刺或KCl誘導大鼠皮層 CSD產生的研究提示，引起大鼠面部、眶周及后爪等部位的皮膚觸痛(allodynia)的刺激是KCl，而非其誘導產生的CSD，并且單獨的CSD事件不足以在正常動物上誘發出現皮膚異常性疼痛，如觸痛等[12]。而最近的一項研究顯示，CSD能顯著誘導自由移動大鼠的僵直、理毛等頭痛相關行為的發生，而使用CGRP (calcitonin gene-related peptide)受體拮抗劑MK-8825可減少的僵直、理毛、甩頭、濕狗征(wet dog shake)等頭痛相關行為的數量。 CGRP受體拮抗劑MK-8825劑量依賴性地減弱CSD誘導的三叉神經介導的疼痛反應[13]。CSD和疼痛行為之間的聯系并沒有在清醒自由移動的嚙齒類動物廣泛評估，仍需要進一步探索，以期構建更加完善的CSD動物模型，明確CSD與偏頭痛疼痛之間的關系。

七、CSD的影響因素

1.基因：偏頭痛具有家族遺傳傾向，目前已知的偏頭痛發病機制研究結果多來自于對家族性偏癱性偏頭痛(familial hemiplegic migraine, FHM)相關基因的研究。FHM是常染色體顯性遺傳的偏癱性偏頭痛(hemiplegic migraine, HM)。HM則是先兆偏頭痛的一種嚴重亞型，其先兆癥狀主要為運動先兆，經常表現為一側肢體暫時性的麻木或無力。由于這種運動先兆具有自發性的特點，且表型顯著、能夠量化，又具有明確的致病因素，因而在偏頭痛發生機制的基礎研究中備受關注。但是具體的遺傳機制尚不明確。HM致病基因有三種，分別編碼三種不同的離子通道：FHM1型基因CACNA1A編碼Cav2.1離子通道α1A亞基，FHM2型基因ATP1A2編碼Na+-K+-ATP酶α2亞基， FHM3型基因SCN1A編碼Nav1.1離子通道的α1亞基。已經培育出的FHM1型致病基因敲入小鼠模型具有明確的CSD誘發易感性，這種易感性與刺激強度呈正相關，并且是由于基因突變導致突觸前膜的谷氨酸能神經元功能失調所致。FHM2型致病基因敲入小鼠模型同樣具有CSD誘發的易感性，且由于星形膠質細胞上的ATP1A2功能喪失，導致星形膠質細胞清楚突觸間隙內谷氨酸能力降低，從而導致突觸后膜的興奮性神經元更加興奮，更易誘發出CSD。與野生型小鼠相比，這些基因敲入小鼠被誘發產生的CSD更易傳播到皮質下結構中[14]。

2.性別：流行病學研究顯示偏頭痛在女性中的發病率較高，女性是男性的2～3倍[15]。嚙齒類動物的CSD易感性也因雌性因素而增加。雌性小鼠表現出誘導CSD的較低閾值，表達人類偏頭痛相關基因的雌性轉基因小鼠與其雄性相比，表現出對CSD的易感性增加。這些發現與女性偏頭痛患病率顯著高于男性相一致，說明性別因素與偏頭痛的關系密切。有動物研究顯示與CSD誘導相關的神經元興奮性在小鼠的自然發情周期中不同。小鼠的自然發情周期包括發情前期、發情期、發情后期、間情期。在發情間期，與其他三期和雄性動物相比，雌性小鼠誘發CSD所需的最低鉀濃度明顯降低；與發情期相比，發情間期雌二醇的血清水平顯著升高，孕激素的血清水平顯著降低。此外，當使用雌激素受體拮抗劑時，CSD傳播的易感性降低；相反，施用孕酮受體拮抗劑增對CSD的敏感性增加[16]。這些研究表明，女性可以與偏頭痛的遺傳傾向相互作用，以進一步增加CSD的傾向。

3.生理狀態：機體的生理狀態也能影響CSD的相關特征。在CSD易感性的動物實驗模型中，必須監測動物系統生理學的變化，必要時采用機械通氣，其中動脈血壓、血氧水平、血糖、體溫能量代謝水平等因素均會影響CSD的相關特征：①動脈血壓能夠影響CSD的持續時間和頻率，研究表明動脈血壓與CSD的持續時間呈反比。低血壓能夠延長CSD的持續時間，而采用持續降低血壓的藥物可降低CSD的頻率。而動脈血壓與CSD閾值之間的關系尚不明確；②血氧水平也是影響CSD特征的重要因素，缺氧條件下CSD的易感性顯著增加[17]。在CSD發生的同時伴隨著離子濃度的變化，而恢復正常的離子濃度梯度需要大量的能量消耗，氧氣利用水平增加，因此缺氧條件下會顯著影響CSD后腦組織正常代謝的恢復；③血糖水平也是影響皮層擴布性抑制的重要因素，高血糖可抑制SD易感性，而低血糖可延長SD持續時間。最近的一項研究發現星形膠質細胞末端的糖原有助于維持細胞外低谷氨酸和突觸周圍的K+濃度，糖原水平在細胞外k+的清除中起關鍵作用[18]。但也有研究認為高血糖水平并不能改變CSD的傳播時間，也不能顯著影響CSD的傳播速度和血流變化；④動脈血氣和PH值也可能間接影響CSD的特征，但尚未得到系統研究。因此，在關于皮層擴布性抑制的相關實驗中，有必要監測這些生理特征并將其保持在正常生理范圍內。

4.麻醉類型：麻醉劑的類型和麻醉的深淺也影響CSD的易感性、傳播頻率和傳播速度等。在一項應用KCl誘導CSD的動物模型中，與丙泊酚和戊巴比妥相比，異氟烷和右旋美托咪定能顯著抑制CSD頻率，且降低CSD的傳播速度[19]。而另一項研究則表明在相同條件下誘發CSD，與丙泊酚相比，異氟烷誘發的CSD數目更少，采用異氟烷的情況下基線血流和血糖更高，組織代謝條件更好[20]。因此不同麻醉劑、不同生理狀態下對CSD的影響也更為復雜。因此在CSD相關實驗中應嚴格控制相關實驗條件，避免使用與測試藥物作用機制相同的麻醉劑，避免混淆結果、降低待測藥物的敏感性。此外，須量化麻醉的相關指標，確定麻醉誘導和維持對CSD易感性的直接影響及權衡麻醉劑對待測藥物或突變之間可能的相互作用。

綜上所述，皮層擴布性抑制與偏頭痛的關系密切，盡管普遍認為皮層擴布性抑制是偏頭痛先兆的病理生理學機制之一，但是皮層擴布性抑制與偏頭痛之間明確的關系并未闡明，因此CSD是否能引發頭痛有待進一步的探索。目前相關CSD動物模型的研究也大多在麻醉狀態下，清醒狀態下研究較少，隨著研究技術的進步，建立更加完善的清醒狀態下動物CSD模型將有助于厘清CSD的特性和偏頭痛相關機制的研究。