Notch信號通路在長春新堿誘導神經病理性疼痛中的作用*

李余星 秦冰杰 劉小虎 譚 瀟 鄭 軍 鄭衛紅△

（1三峽大學醫學院 國家中藥藥理科研三級實驗室，宜昌443002；2三峽大學第一臨床醫學院肝膽胰外科研究所，宜昌443003；3宜都市第一人民醫院藥劑科，宜昌443300）

由軀體感覺神經直接損傷或疾病引起的疼痛稱為神經病理性疼痛，是臨床最為難治的慢性疼痛之一。長春生物堿類（長春新堿，vincristine, VCR）是目前臨床常用的抗腫瘤化療藥物，在抗腫瘤治療中發揮重要作用。然而，目前國內外有越來越多的報道提示[1～4]，其單用或合用在抗腫瘤的同時會產生神經損傷毒性作用，誘發痛覺過敏和超敏反應，稱化療誘導的神經病理性疼痛(chemotherapy-induced neuropathic pain, CINP)，簡稱化療痛。此疼痛制約了腫瘤的進一步加量化療，并降低了腫瘤病人的生活質量，也降低了長春生物堿類藥物的抗腫瘤療效[5～7]。目前其發病機制尚未完全闡明，并缺乏有效的治療措施。因此，研究化療痛的發生發展機制、尋找能減輕或消除化療痛發生發展的藥物和方法是當今國內外該領域里亟待解決的課題。

隨著對神經病理性疼痛研究的不斷深入，藥物治療的新靶點不斷被發現，如小膠質細胞通路[8]、P38 MAPK通路[9]、神經生長因子抗體[10]、電壓門控鈉離子通道阻滯劑、WNT信號通路抑制劑[11]等。其中，本課題組前期研究[12]已證實脊髓背角小膠質細胞活化通路參與了VCR誘導的神經病理性疼痛的發生、發展。而之前已有研究表明[13,14]，小膠質細胞的激活與Notch信號通路激活密切相關，抑制Notch信號通路可顯著抑制小膠質細胞活化，從而降低促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的表達，減輕神經元的損傷。 Sun 等人的研究也發現[15]，大鼠坐骨神經損傷引起神經病理性疼痛，其脊髓Notch信號的表達和活性顯著增加，痛域值顯著降低；抑制Notch信號通路則逆轉了大鼠神經損傷后產生的痛覺過敏。但化療藥VCR誘導的神經病理性疼痛發生發展是否也與脊髓背角Notch信號通路的活化相關，能否通過抑制Notch信號通路的活化來緩解化療痛大鼠痛覺過敏反應，目前尚無相關文獻報道。本研究建立VCR誘導神經病理性疼痛大鼠模型，并通過鞘內注射Notch信號通路活化的抑制劑DAPT，檢測大鼠痛閾值變化及其Notch信號通路活化胞內段NICD、核內下游基因Hes1 mRNA的表達，從Notch信號通路進一步探討化療誘導的神經病理性發生發展機制，為治療化療痛尋找新的靶點提供理論依據。

方 法

1.材料

（1）主要試劑：Notch信號通路抑制劑DAPT購自Selleck公司（批號：S2215）；注射用硫酸長春新堿購自深圳萬樂藥業有限公司（批號：H44021772）；Anti-NICD antibody（Abcam公司）；正常山羊血清封閉液（谷歌生物）。

（2）實驗儀器：Von Frey電子測痛儀（深圳瑞沃德公司）；PL-200熱刺痛儀（成都泰盟科技有限公司）；DM.4-YLS-21A冷熱板測痛儀（北京達美達科技有限公司）；迷你轉印電泳儀（北京六一儀器廠）；熒光倒置顯微鏡（尼康TE-2000，日本）；全波長酶標儀（Tecan Austria GmbH公司）。

（3）實驗動物：實驗采用三峽大學實驗動物中心提供SPF級Sprague-Dawley健康雌性大鼠,體重在220～240 g左右（動物生產許可證號：SCXK（鄂）2011-0012）。大鼠飼養環境恒溫(22±2)℃，濕度為(60±5)%，12 h交替光照，自由攝食飲水，實驗動物設施使用許可證號：SYXK（鄂）2011-0061）。實驗動物適應環境3 d后行鞘內置管術，手術成功的大鼠按熱痛閾值大小，采用隨機區組法進行分組，并單籠飼養。動物使用經過倫理委員會的批準。

2.方法

（1）大鼠鞘內置管：縱向切開約2 cm的大鼠髂棘水平連線為中點的皮膚，分離剔除大鼠L5、L6腰椎棘突周圍的肌肉組織，充分暴露進針點。用1 ml注射器的針頭輕探測，出現落空感并伴隨大鼠側向甩尾動作，即為精準進管位置，快速在該位置插入注滿高壓消毒的生理鹽水的PE 10管。若再次觀察到大鼠側向甩尾，并發現PE 10管中流入腦脊液，說明初步置管成功。將大鼠背頸脖處做一切口，灌胃針由此切口穿入沿皮下至大鼠背部刀口將置管引出，立即熱熔封閉PE 10管并縫合傷口。對大鼠進行消毒處理，肌肉注射青霉素鈉8萬IU/只，防止傷口感染。置管三天后，大鼠鞘內注射2 %利多卡因10 μl。若大鼠的雙后肢出現癱軟并拖地行走且在30 min后恢復正常行走，表明該大鼠可用于實驗；反之，則剔除。

（2）實驗動物分組及化療痛動物模型的建立：將已鞘內插管的SD大鼠進行熱痛行為學實驗，并挑選出熱痛閾值合格SD大鼠，按熱痛閾值大小篩選實驗大鼠并隨機區組分為4組，每組10只：①對照組 (control)：鞘內注射(i.t.) DMSO (10 %, 1 μl)共8次(D0～D7)；再隔日腹腔注射(i.p.)生理鹽水0.5 ml /100 g，共4次(D1、D3、D5、D7)；②VCR致化療痛模型組 (VCR)：i.t.DMSO (10%, 1 μl)共8次(D0～D7)；再隔日i.p.VCR 125 μg/kg，共4次(D1、D3、D5、D7)；③DAPT多次給藥+ VCR組(DAPT(8)+VCR)：i.t.γ分泌酶抑制劑-DAPT（Notch信號通路抑制劑）(50 μg/μl, 1 μl)共8次(D0 ～ D7)；再 間 隔 日 i.p.VCR 125 μg/kg， 共 4 次 (D1、D3、D5、D7)；④DAPT單次給藥+ VCR組 (DAPT(1)+VCR)：i.t.DAPT (50 μg/μl, 1 μl) 共 1 次 (D0)；i.t.DMSO (50 μg/μl, 1 μl)共 7 次 (D1 ～ D7)；再間隔 日 i.p.VCR 125 μg/kg， 共 4次 (D1、D3、D5、D7)。以首次鞘內給藥DAPT為第0 d，即D0。在D0、D8測定4組實驗大鼠機械痛、熱痛和冷痛閾值。并于D9處理大鼠。0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對實驗大鼠進行深度麻醉，一部分大鼠用4%多聚甲醛進行活體灌注固定，并取出脊髓腰膨大L4-L6組織，放4%多聚甲醛中浸泡，置4℃冰箱內備用。另一部分已麻醉大鼠置于冰盒上取出新鮮的L4-L6脊髓組織，放入預冷的生理鹽水中沖洗脊髓，再放入冷凍盒中，于-80℃中保存備用。

（3）行為學檢測：將大鼠置于有機玻璃籠內適應環境30 min，待大鼠安靜后，分別使用用電子von Frey測痛儀、熱刺痛儀器和冷板測痛儀測定痛閾值。左右足各測3次，刺激間隔15 min，記錄大鼠出現撤足反應時測痛儀所顯示的刺激強度大小，計算左右共6次刺激痛閾值結果的平均值，分別作為大鼠機械痛、熱痛和冷痛的刺激痛閾值。

（4）免疫組化法檢測NICD蛋白：取固定好的脊髓腰膨大段L4-L6，制備成脊髓組織石蠟切片。取切片脫蠟后分別用pH 9.0 EDTA對NICD切片進行抗原修復。經3% H2O2孵育，5% BSA室溫封閉，加入NICD（稀釋度1:200, ab8925, abcam） ，4℃孵育過夜，再加入二抗：HRP標記的山羊抗兔IgG(1:500, GB23303, Servicebio)，避光室溫下作用1 h，DAB顯色和蘇木精復染細胞核，封片后立即于顯微鏡下觀察并拍照，并用圖像分析軟件進行灰度分析。

（5）Western blot檢測NICD蛋白：在冰上迅速取出脊髓腰膨大部位（L4-L6節段），加入10倍于組織塊的冰凍裂解液后用電動勻漿器進行勻漿，4℃下12 000 rpm離心10 min，用BCA法進行蛋白定量測定。配置12%的分離膠，和5%的濃縮膠，濃縮膠電泳條件為80 V恒壓，分離膠電泳條件為120 V恒壓，當溴酚藍染料前端電泳至分離膠末端處時即停止電泳，轉膜后5%脫脂奶粉封閉1 h，加入NICD，GAPDH一抗：NICD （稀釋度1:500,ab8925, abcam）；GAPDH （稀釋度1:10000, sc25778,santa cruz biotechnology），4℃孵育過夜后TBST洗膜3次，每次5 min。加入TBST稀釋的二抗：HRP標記的山羊抗兔IgG (1:3 000, GB23303,Servicebio)，室溫孵育30 min后TBST洗膜3次，每次5 min。ECL反應、顯、定影后使用圖像分析系統進行數據分析。

（6）RT-PCR法檢測Hes1 mRNA：采用Trizol法提取每一脊髓組織的總RNA。按照TaKaRa說明書步驟依次加入各試劑反轉錄，各組產物cDNA用于PCR或者-20℃保存。用Primer 5設計引物如下：Hes1-F：5' CTACCCCAGCCAGTGTCAAC3'；Hes1-R：5' CCCCAACACGCTCGGGTCTG3'。GAPDH-F：5' GCAAGTTCAACGGCACAG3'；GAPDH-R：5' CTCAACAGTATAAAGAGC3'。按照NovoStar Green PCR Mix說明依次加入上下游引物、各組產物cDNA、分子生物水制備25 μl PCR擴增反應體系的混合物，混勻后置于PCR儀進行PCR擴增實驗。反應結束后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。配制2%瓊脂糖凝膠，上樣，電泳，電壓120 V，電流50 mA，電泳時間1 h。紫外凝膠成像儀檢測。采用軟件Image-Pro Plus 6對電泳條帶進行灰度值(IOD)分析。

3.統計學方法

實驗結果采用SPSS 13.0軟件包進行統計分析，痛閾值分析采用隨機區組設計的方差分析，灰度值比較采用單因素方差分析，并用least significant difference (LSD) 法做兩兩比較，計量資料以均數±標準差() 表示，P? 0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.大鼠痛閾值的變化

圖1 各組大鼠機械痛(A)、熱痛(B)、冷痛(C)閾值變化 (n=10,D)Fig.1 The change of the mechanical (A), thermal (B), cold(C) pain threshold in rats (n=10,D)

圖1為各組大鼠機械痛(A)、熱痛(B)及冷痛(C)閾值變化。給藥前各組大鼠行為學痛閾值差異均無統計學意義(P＞0.05)。造模第8 d檢測各組大鼠痛閾值顯示：與對照組比較，VCR組大鼠機械痛、熱痛及冷痛痛閾值均顯著降低(P?0.01)，提示VCR誘導大鼠產生痛覺過敏反應，即成功建立大鼠化療痛模型；與VCR組比較，DAPT多次給藥+ VCR組和DAPT單次給藥+ VCR組機械痛、熱痛及冷痛痛閾值明顯升高（P?0.05或P?0.01），表明當Notch信號通路活化被抑制后，化療痛大鼠的痛覺敏化反應得到緩解；與DAPT多次給藥+ VCR組比較，DAPT單次給藥+ VCR組大鼠機械痛、熱痛及冷痛痛閾值沒有差異(P＞0.05)，表明Notch信號通路抑制劑DAPT多次給藥和單次給藥可以達到相同作用效應。以上結果提示VCR隔日腹腔注射4次，可成功建立VCR誘導大鼠化療痛模型，Notch信號通路抑制劑DAPT可在初次鞘內注射后即可達到抑制Notch信號通路的作用。

2.免疫組化法檢測大鼠脊髓背角NICD蛋白的表達

圖2為免疫組化檢測各組大鼠NICD表達(A)及NICD平均灰度值(B)。與對照組比較，VCR組NICD的表達顯著增加，其平均灰度值明顯升高(P?0.01)，表明活化的Notch信號通路參與VCR誘導的神經病理性疼痛的發生與發展；與VCR組比較，DAPT多次給藥+ VCR組和DAPT單次給藥+ VCR組NICD表達和平均灰度值均顯著降低(P?0.01)，表明抑制Notch信號通路活化可緩解VCR誘導的大鼠化療痛；與DAPT多次給藥+VCR組比較，DAPT單次給藥+ VCR組NICD的表達無顯著變化(P＞0.05)，表明單次鞘內注射DAPT即可阻斷Notch信號通化。

3.Western Blot法檢測大鼠脊髓背角NICD蛋白的表達

與對照組比較，VCR組大鼠NICD表達顯著升高(P?0.01)；與VCR組比較，DAPT多次給藥+ VCR組和DAPT單次給藥+ VCR組大鼠NICD表達均降低，且具有統計學差異(P?0.01)，表明抑制Notch信號通路的活化，大鼠NICD的表達下調；與DAPT多次給藥+ VCR組比較，DAPT單次給藥+ VCR組大鼠NICD的表達并無變化，表明單次給予DAPT即可抑制Notch信號通路的活化（見圖3）。

4.RT-PCR法檢測大鼠脊髓背角Hes1 mRNA的表達水平

與對照組比較，VCR組大鼠Notch信號通路核內下游基因Hes1 mRNA表達水平顯著升高(P?0.01)，表明VCR激活Notch信號通路誘導大鼠產生神經病理性疼痛。與VCR組比較，DAPT多次給藥+ VCR組和DAPT單次給藥+ VCR組大鼠Hes1 mRNA表達水平均顯著降低(P?0.01)，表明抑制Notch信號通路的活化，VCR誘導的化療痛大鼠的Notch信號通路核內下游基因Hes1 mRNA表達水平降低。與DAPT多次給藥+ VCR組比較，DAPT單次給藥+ VCR組大鼠Hes1 mRNA表達水平并無變化(P＞0.05)，表明單次給予DAPT即可抑制Notch信號通路的活化（見圖4）。

討 論

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體（DSL蛋白）、NICD轉運分子和下游靶基因如Hes、Hey等信號傳導分子等組成[16]。Notch信號是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用而產生，Notch蛋白經過三次剪切，由胞內段(NICD)釋放入胞質，并進入細胞核與轉錄因子CSL結合, 形成NICD/CSL轉錄激活復合體，從而激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環-螺旋 (basichelix-loophelix, bHLH)轉錄抑制因子家族的靶基因，發揮生物學作用。Xie等[17]發現，絲線結扎坐骨神經干建立坐骨神經結扎損傷模型(chronic constriction injury,CCI)和選擇性坐骨神經損傷模型(spared nerve injury, SNI)時大鼠機械和熱痛域值顯著降低，鞘內注射γ-分泌酶抑制劑DAPT，可明顯增加大鼠的機械痛閾值和熱輻射痛閾值，表明抑制Notch信號通路可預防或逆轉早期或晚期的神經損傷型神經病理性疼痛；而作為Notch信號傳導途徑配體的jagged-1肽則呈劑量依賴性地誘導正常大鼠的神經性疼痛樣行為，提示Notch通路的活化可能參與了神經損傷引起神經病理性疼痛的產生和發展。

圖2 各組大鼠脊髓背角NICD的表達(A)及平均灰度值(B) (n=10,D)（免疫組化法 ×200）Scale bar=200 μmFig.2 Expression (A) and integrated optical density (B) of NICD in spinal dorsal horn of rats (n=10,D)(Immunohistochemistry ×200) Scale bar=200 μm

圖3 各組大鼠脊髓背角NICD表達變化 (n=10,D)Fig.3 Expression of NICD in spinal dorsal horn of rats(n=10,D)

圖4 各組大鼠脊髓背角Hes1 mRNA表達水平變化(n=10,D)Fig.4 Expression of Hes1 mRNA in spinal dorsal horn of rats (n=10,D)

本研究參考文獻方法[18]用化療藥物長春新堿腹腔注射建立化療藥誘導大鼠神經病理性疼痛模型，結果顯示：VCR組大鼠機械痛閾值、熱痛閾值和冷痛閾值均顯著降低，證明化療痛模型成功建立。同時，VCR組化療痛大鼠脊髓背角Notch信號通路活化標志物NICD蛋白、核內下游基因Hes1 mRNA表達均顯著增高。鞘內給予Notch信號通路抑制劑DAPT后，發現化療痛大鼠的痛閾值均顯著提高，其痛覺過敏反應得到明顯緩解，大鼠脊髓背角NICD蛋白、Hes1 mRNA表達均明顯降低，且DAPT單次鞘內注射與多次鞘內注射的抑制作用無差異(P＞0.05)。提示Notch信號通路的活化在VCR誘導的神經病理性疼痛中發揮關鍵作用。

該研究表明VCR誘導的大鼠神經病理性疼痛與Notch信號通路活化密切相關，且單次鞘內注射DAPT即可產生顯著的抑制效應，從而達到緩解化療痛的療效。且本課題組前期研究已證實[12]化療藥誘導的神經病理性疼痛的發生發展與小膠質細胞活化通路相關。由此我們推測化療藥誘導神經病理性疼痛的作用機制可能也是通過激活Notch信號通路，繼而導致小膠質細胞活化通路活化，促使炎性細胞因子的釋放而產生的。然而，Notch信號通路活化對小膠質細胞活化通路的激活是直接作用，還是間接作用的結果，以及而且二者之間是否存在相互遞進的關系，尚有待進一步研究闡明。總之，本研究結果提示：抑制Notch信號通路可作為治療化療藥誘導的神經病理性疼痛的新途徑，為臨床治療化療痛提供了新思路。