枯草芽孢桿菌中一種新型雙向啟動子的功能鑒定

柴昊男，張會圖，袁飛燕，劉煥，路福平

枯草芽孢桿菌中一種新型雙向啟動子的功能鑒定

柴昊男，張會圖，袁飛燕，劉煥，路福平

天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457

本研究旨在通過轉錄組分析預測的方法，由地衣芽孢桿菌中篩選獲得一種新型雙向啟動子，鑒定其啟動強度。以已知強組成型啟動子pShuttle-09為對照，檢測其對克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因的表達活性。成功構建了3種重組堿性蛋白酶表達載體及對應的工程菌株。在新型啟動子pLA和其反向啟動子pLB調控轉錄下，克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶表達活性達到 164 U/mL和111 U/mL。結果表明，pLA的啟動強度明顯高于pShuttle-09和pLB，pLA啟動子與pLB啟動子均可表達堿性蛋白酶。從而為枯草芽孢桿菌表達系統中異源基因的表達提供一個新的方向，也為原核生物中共同表達兩種基因提供了新的思路。

雙向啟動子，芽孢桿菌，堿性蛋白酶

枯草芽孢桿菌表達系統作為基因工程表達系統，因具有外源蛋白易分離純化[1]、適應大規模流線發酵過程[2]、安全性 (GRAS認證)[3]及無偏倚密碼子的使用[4]等多種優勢，使其在表達異種蛋白方面處于首選位置，因此枯草桿菌在酶工業應用中得到了廣泛的應用[5]。

工業酶的全球市場估計為16億美元，其中包括食品酶(29%)、飼料酶(15%)和通用技術酶(56%)[6]。目前市場上使用的大多數洗滌劑蛋白酶是芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶[7]。據估計，芽孢桿菌產酶約占整個酶市場的50%[8]。外源蛋白在芽孢桿菌中的高效表達是實現其在工業應用上的重要途徑，啟動子是影響外源蛋白在芽孢桿菌中高效表達的關鍵因素之一[9]。

蛋白質的相互作用是實現功能的基礎。對蛋白質的功能研究需要考慮蛋白質之間的相互作用，特別是對二聚體的研究，往往需要在同一載體中表達兩種蛋白質[10]。構建過程通常將兩個不同的啟動子插入同一載體，或將兩種蛋白質構建成融合蛋白，但都有可能增加轉化的難度或影響外源基因的表達。利用雙向啟動子的啟動功能，可以為蛋白質之間的相互作用的研究提供新思路[11]。

雙向啟動子是反向轉錄基因對的共享啟動子序列，可以調控兩個方向的基因的轉錄[12]。雙向啟動子在真核生物基因組中廣泛分布，大多數的雙向啟動子具有較高的GC含量和豐富的CpG島，而缺少TATA盒。雙向啟動子的雙向轉錄機制一種解釋是兩個RNA聚合酶同時聚集在無核小體的復制起始區，然后在兩個方向上起始轉錄[13]。盡管大部分雙向啟動子在兩個方向上都有表達活性，但是有約1/10都只在一個方向上進行表達。大多數雙向啟動子調控雙向基因對的共表達，少部分雙向啟動子一個方向促進轉錄，另一個方向抑制[14]。雙向啟動子在原核生物中少有報道，主要集中在大腸桿菌表達系統。常用的原核生物雙向啟動子是MaZel團隊在霍亂弧菌中發現的Pc/Pint[15]。廖昱泓等發現真核生物酵母基因中的雙向啟動子即1基因啟動子區在原核生物大腸桿菌中仍具有雙向啟動的功能[11]。新的雙向啟動子的發現，實現了芽孢桿菌基因工程的“一箭雙星”的功能，為原核生物雙向啟動子的研究補充了參考數據，對于加速芽孢桿菌基因工程的研究進展具有重要意義[16]。

目前，國內外由基因組中篩選獲取新型啟動子的方法主要包括運用啟動子探針載體篩選[17]、常規PCR法[18]、序列特異性引物PCR法[19]和基因組文庫篩選法[20]等。本研究從地衣芽孢桿菌中篩選獲得一種新型的雙向啟動子，即在地衣芽孢桿菌轉錄組測序結果的基礎上，運用生物信息學等分析獲得的和基因 (編碼lichenicidin prepeptide) 的啟動子pLA/pLB，以強啟動子pShuttle-09為對照，以克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因為報告基因，鑒定新型啟動子的啟動強度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌EC135來自南開大學，枯草芽孢桿菌WB600、地衣芽孢桿菌2709和大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達載體pWH1520均為本實驗室保藏。

1.1.2 試劑和培養基

DNA聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；GeneRuler 1 kb DNA Ladder購自賽默飛世爾科技公司；基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA切膠回收試劑盒購自Omega Biotek核酸純化公司；福林酚、酪蛋白底物、三氯乙酸等購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。

牛奶平板培養基 (100 mL)：酵母粉0.5 g，蛋白胨1 g，氯化鈉1 g，瓊脂1.5 g，脫脂奶粉1 g；種子培養基100 mL：酵母粉0.5 g，蛋白胨1 g，氯化鈉1 g。

發酵產酶培養基 (100 mL)：玉米粉6.4 g，豆餅粉4 g，磷酸氫二鈉0.4 g，磷酸二氫鉀0.03 g，高溫淀粉酶0.07 g。

枯草芽孢桿菌感受態制備培養基：電轉化感受態制備重懸液 (溶液A)：D-山梨醇0.5 mol/L，D-甘露醇0.5 mol/L，甘油10%，加去離子水定容，121 ℃滅菌20 min。電轉化復蘇液 (溶液B)：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉5 g/L，D-山梨醇0.5 mol/L，D-甘露醇0.38 mol/L，加去離子水定容，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 地衣芽孢桿菌啟動子篩選

接種地衣芽孢桿菌2709于無菌LB平板上，37 ℃培養過夜，挑取單菌落于種子培養基中，220 r/min過夜培養，按2%接種量分別接種于100 mL發酵培養基，37 ℃、220 r/min振蕩培養，每隔12 h進行取樣，離心收集上清液，進行產酶活力測定，對蛋白酶表達量較高的樣品進行轉錄組測序分析。在地衣芽孢桿菌的轉錄組測序結果的基礎上，運用生物信息學結合BPROM軟件預測基因的轉錄起始位點，并將轉錄起始位點上游500 bp的核苷酸進行分析，尋找與之匹配的σ因子和轉錄因子的識別位點，從而發現啟動子候選基因。

1.2.2 地衣芽孢桿菌基因組提取

地衣芽孢桿菌基因組DNA使用OMEGA公司Bacterial DNA Kit提取，步驟如下：

1) 收集過夜培養于LB培養基中的菌液，13 000 r/min離心3 min，棄上清，重懸菌體于200 μL無菌水中；2) 加40 μL溶菌酶，37 ℃恒溫水浴30 min，加100 μL BTL Buffer和30 μL蛋白酶K，輕輕顛倒混勻，55 ℃振蕩水浴45 min；3) 加5 μL RNase A，顛倒混勻，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心2 min；4) 取上清，加入220 μL BDL Buffer，顛倒混勻，65 ℃恒溫水浴10 min；5) 加入220 μL無水乙醇，最大速度振蕩20 s，轉移所有液體 (包括沉淀) 至吸附柱中，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；6) 加入500 μL HBC Wash buffer，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；7) 加入600 μL DNA Wash buffer，12 000 r/min離心1 min，棄底液，重復1次；8) 12 000 r/min空離2 min，將吸附柱取出，放入一個新的1.5 mL無菌EP管中，開蓋晾干；9) 加入40 μL預熱的無菌雙蒸水，靜置 2 min，12 000 r/min離心1 min，重復2次，基因組即被收集到EP管中。

1.2.3 啟動子片段、蛋白酶基因的克隆

由轉錄組分析結果可知，基因和之間有一段137 bp的序列，能夠分別驅動這兩段基因的表達 (圖1)。通過在線分析軟件BPROM預測這段啟動子區域的?35區和?10區，發現正義鏈啟動子pLA與反義鏈啟動子pLB的?10區有重疊。

分別通過引物pLA-F/pLA-Alk-R和pLB-F/ pLB-Alk-R (表1)，以該地衣芽孢桿菌基因組為模板，PCR獲得大小為137 bp的pLA和pLB片段。PCR反應體系為：ddH2O 33.8 μL，基因組模板2 μL，上游引物和下游引物各2 μL，10×Pyrobest 緩沖液5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 5 μL，Pyrobest DNA聚合酶0.2 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸8 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收分離純化PCR產物。

圖1 基因lanA1和lanA2以及雙向啟動子在基因組中的相對位置

表1 引物及核苷酸序列

The lowercase: protective base sequence.

啟動子pShuttle-09 (以下簡寫為pS) 通過引物pS-F/pS-Alk-R (表1) 經PCR擴增獲得，片段大小為215 bp。

報告基因為克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(GenBank Sequence ID：FJ940727.1)。根據編碼基因序列，使用引物Alk-pLA-F、Alk-pLB-F、Alk-pS-F和alk-R通過PCR擴增獲得大小為1 143 bp的基因片段。重疊PCR獲得大小為1 280 bp、1 280 bp和1 358 bp的3個片段pLA-Alk、pLB-Alk和pS-Alk。

1.2.4 重組表達載體的構建

PCR產物膠回收得到的啟動子片段與報告基因片段使用Ⅰ和Ⅰ酶切，與使用Ⅰ和Ⅰ雙酶切的pWH1520表達載體連接后轉化大腸桿菌EC135，提取驗證成功的重組載體再通過如下方法轉入枯草芽孢桿菌WB600細胞中。

1) 挑取新活化的枯草芽孢桿菌單克隆菌株于20 mL LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min搖床振蕩培養12 h；2) 取600 μL培養物分別接種至含有不同Gly濃度 (0、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%) 的30 mL LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min培養16 h，測定600，計算不同濃度Gly對菌體生長的抑制率；3) 取Gly抑制率在60%–75%的菌懸液2.0 mL轉接至50 mL含相同濃度Gly的LB培養基，37 ℃、220 r/min繼續培養至600為0.5–0.6；4) 將上述培養好的菌液冰浴10 min，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，棄上清，倒置，使培養液流盡；5) 用預冷的溶液A重懸菌體，輕輕混勻，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，重復3次；6) 用預冷的溶液A重新懸浮細胞，無菌條件下分裝于預冷的1.5 mL EP管中，每管80 μL，?80 ℃保存備用；7) 取制備好的感受態細胞，無菌條件下加入重組質粒，輕輕吹吸混勻；8) 吸取感受態細胞與DNA的混合物至2 mm預冷的電轉杯中，冰浴 3 min，電擊 (電壓2 500 V)，迅速加入1 mL溶液B，混勻，37 ℃、220 r/min復蘇3 h；9) 4 000 r/min離心5 min，取適量涂布于20 μg/mL 四環素抗性篩選平板，37 ℃倒置培養，12 h后挑取轉化子單菌落于5 mL LB試管，培養后提取質粒DNA并驗證。

重組蛋白酶表達載體分別命名為pS-alk- pWH1520、pLA-alk-pWH1520、pLB-alk-pWH1520，對應的重組基因工程菌分別為pS-alk-pWH1520- WB600、pLA-alk-pWH1520-WB600、pLB-alk- pWH1520-WB600。

1.2.5 重組蛋白酶基因工程菌的表達

將新鮮平板上的3株重組基因工程菌的單菌落點接牛奶板培養，選取透明圈較大的轉化子分別點接脫脂牛奶平板并接入50 mL四環素抗性種子培養基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養12 h，以相同的接種量轉接于含有四環素的發酵培養基中，于37 ℃、220 r/min發酵培養，每隔12 h收集發酵液，4 ℃、12 000 r/min離心取上清。

堿性蛋白酶酶活測定參照GB/T 23527-2009附錄B福林酚法進行，1個酶活力單位 (U/mL) 定義為1 mL酶液在40 ℃、pH為10.5條件下反應1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需要的酶量[21]。

2 結果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌啟動子篩選

對地衣芽孢桿菌2709進行發酵培養，分別取12、48、60 h的發酵液，由蘇州金唯智生物科技有限公司進行轉錄組測序。從測序結果中發現存在兩段“頭對頭”[22]的基因 (部分數據見表2)，且兩段基因的表達強度較高。將兩段基因序列在NCBI (http://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST)中進行同源性比較，其編碼基因為和基因。

表2 地衣芽孢桿菌中兩個啟動子表達的基因的轉錄組數據

RPKM: reads per kilobase per million mapped reads.

2.2 重組表達載體的構建

各個重組表達載體的構建過程如圖2所示。通過PCR擴增以及DNA切膠回收，獲得大小為1 280 bp、1 280 bp和1 358 bp的3個片段pLA-Alk、pLB-Alk和pS-Alk，及通過Ⅰ和Ⅰ雙酶切并切膠回收獲得的7 694 bp的pWH1520載體片段。重組載體連接產物分別轉化大腸桿菌EC135，提取質粒驗證正確后電轉化WB600感受態。

通過四環素抗性平板篩選轉化子提取質粒DNA，再次進行驗證并由蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序，測序分析與實驗結果完全一致，證明報告基因和啟動子片段成功克隆到載體上。重組蛋白酶表達載體pS-alk-pWH1520、pLA-alk-pWH1520、pLB-alk-pWH1520，以及所對應的工程菌pS-alk-pWH1520-WB600、pLA-alk- pWH1520-WB600、pLB-alk-pWH1520- WB600構建成功。

2.3 不同啟動子對克勞氏堿性蛋白酶基因啟動功能的分析

將3種重組菌株在牛奶板上培養24 h，結果如圖3所示，pLA-alk-pWH1520-WB600的透明圈大小明顯大于另外兩者。

測定不同時間發酵上清液中堿性蛋白酶的酶活，每組實驗作3個平行，結果取平均值 (圖4)。發酵培養 36 h后，蛋白酶產量大幅提升，60 h后，蛋白酶產量趨于穩定。發酵培養84 h，3種啟動子pS、pLA、pLB表達克勞氏堿性蛋白酶的活性分別達到114、164、111 U/mL，說明pLA的啟動強度明顯高于pS和pLB，pLA啟動子與pLB啟動子均可表達堿性蛋白酶。

圖2 重組載體的構建過程

圖3 三種重組工程菌株對蛋白質的分解能力

圖4 三種啟動子對堿性蛋白酶基因的表達活性

3 討論

真核生物中大部分雙向啟動子缺少TATA盒，而均具有較高的GC含量并與CpG島存在高度的相關性，小于1 kb的雙向啟動子的數量與基因組大小大致成負相關[13]。原核生物雙向啟動子樣本較少，目前已知數據很難歸類總結，有待進一步的研究發現。就啟動子pLA/pLB個體而言，它是啟動子序列反向互補的雙向啟動子，啟動子序列重疊，雙向轉錄基因對5′端不重疊[23](見圖1)。序列相對于其他已知原核雙向啟動子較短，GC含量約為32.85%，不含有CpG島。

通過在線分析軟件BPROM對篩選所獲得的啟動子pLA與pLB進行結構預測和分析，結果如圖5所示。pLA與pLB均具有能被σA因子識別的保守序列?35區和?10區，且SD序列與起始密碼子之間的距離均為8 bp。啟動子pLA有4個轉錄調控因子結合位點：兩個RNA聚合酶σ因子RpoD17 (結合位點為TTTATAAT和CAATTCTA)、精氨酸抑制因子ArgR (TTATAATT) 和脫氧核糖核酸調節因子DeoR (AATTCTAA) 的結合序列。啟動子pLB有2個轉錄調控因子結合位點：RpoD17 (ATACTATA) 和整合宿主因子IHF (Integration host factor，binding sites：ACAAAAAA) 的結合序列。

啟動子pShuttle-09來源于地衣芽孢桿菌，是一個雜合啟動子，其表達強度是枯草芽孢桿菌強啟動子P43的8倍[24]。含有兩對典型的保守序列，均被σA因子識別。有4個轉錄調控因子結合位點：磷酸鹽調節子轉錄調控蛋白PhoB (TCATAAAA)、ArgR (CATAAAAA)、嘌呤調節子阻遏蛋白PurR (ATAAAAAG) 和RNA聚合酶σ因子RpoD16 (TGATATAA) 的結合序列。

啟動子的啟動強度主要取決于啟動子的結構，一般來說，兩保守區序列?35區和?10區間隔為 (17±1) bp時啟動活性最強，而SD序列與起始密碼子之間的距離也是決定啟動子強度的關鍵因素，通常為10 bp[25]。pLA和pS兩保守區之間間隔為17 bp和18 bp，pLB為14 bp，這可能是造成pLB的啟動活性低于pLA的主要原因。而pLA、pLB中SD序列與起始密碼子均相距8 bp，pS中二者相距4 bp，這可能是pLA表達活性高于pS的原因之一。

構建的工程菌株堿性蛋白酶產量仍然較低，構建用于工業生產的菌株時可選擇分泌強度更高的信號肽及拷貝數更高的表達載體。

圖5 雙向啟動子結構分析

4 結論

本研究將啟動子pLA/pLB以兩種不同的方向克隆進同一種質粒中，以克勞氏堿性蛋白酶基因作為報告基因并轉化枯草芽孢桿菌細胞，成功構建了3種重組表達載體pS-alk-pWH1520、pLA-alk-pWH1520、pLB-alk-pWH1520及對應的3種工程菌株。通過檢測堿性蛋白酶的酶活力，證實了該啟動子在原核生物枯草芽孢桿菌中有雙向啟動能力，即基因啟動子區可進行兩個方向的轉錄，且5′–3′方向的啟動子啟動強度明顯大于3′–5′方向的啟動子。從而為枯草芽孢桿菌表達系統中異源基因的表達提供一個新的方向，也為原核生物中共同表達兩種基因提供新的思路。

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Characterization of a novel bidirectional promoter in Bacillus subtilis

Haonan Chai, Huitu Zhang, Feiyan Yuan, Huan Liu, and Fuping Lu

Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, College of Biotechnology, Tianjin University of Science &Technology, Tianjin 300457, China

Based on the transcriptome analysis data of a, a novel bidirectional promoter was identified from the strain and its transcriptional strength was analyzed. The expression level of aderived alkaline protease gene driven by the bidirectional promoter was studied by using the known strong constitutive promoter pShuttle-09 as a control. Three recombinant expression vectors and the corresponding recombinant bacteria were constructed. Under the control of the new promoter pLA and its reverse promoter pLB, the alkaline protease expression level respectively reached 164 U/mL and 111 U/mL. The results indicated that the transcription strength of pLA was significantly higher than that of pShuttle-09 and pLB, and both the pLA and pLB promoters could initiate the expression of the alkaline protease. Thus, it provides a new expression element for the heterogenous genes insp. and a new idea for the co-expression of two genes in one prokaryotic strain.

bidirectional promoter,, alkaline protease

January 15, 2019;

April 2, 2019

National Key Research and Development Program of China (No. 2017YFB0308401).

Fuping Lu. Tel: +86-22-60602268; E-mail: lfp@tust.edu.cn

國家重點研發計劃 (No. 2017YFB0308401) 資助。

柴昊男, 張會圖, 袁飛燕, 等. 枯草芽孢桿菌中一種新型雙向啟動子的功能鑒定. 生物工程學報, 2019, 35(7): 1326–1334.

Chai HN, Zhang HT, Yuan FY, et al. Characterization of a novel bidirectional promoter in. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1326–1334.

(本文責編 郝麗芳)