天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合酶的異源表達(dá)、活性分析及重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖的條件優(yōu)化

吳傲，張顯，徐美娟，楊套偉，李華鐘，饒志明

天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合酶的異源表達(dá)、活性分析及重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖的條件優(yōu)化

吳傲，張顯，徐美娟，楊套偉，李華鐘，饒志明

江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

從天藍(lán)色鏈霉菌克隆得到海藻糖合酶基因()，在大腸桿菌BL21(DE3) 中進(jìn)行了異源表達(dá)，通過 Ni-NTA 親和柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到純酶，經(jīng) SDS-PAGE 測(cè)定其分子量約為62.3 kDa。研究其酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)該酶最適溫度35 ℃；最適pH 7.0，對(duì)酸性條件比較敏感。通過同源建模和序列比對(duì)分析，對(duì)該基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。突變酶K246A比酶活比野生酶提高了1.43倍，突變酶A165T相對(duì)提高了1.39倍，海藻糖轉(zhuǎn)化率分別提高了14%和10%。利用突變體重組菌K246A進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化優(yōu)化海藻糖的合成條件并放大進(jìn)行5 L罐發(fā)酵，結(jié)果表明：在麥芽糖濃度300 g/L、初始反應(yīng)溫度和pH分別為35 ℃和7.0的條件下，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到71.3%，產(chǎn)量為213.93 g/L；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥?00 g/L時(shí)，海藻糖產(chǎn)量仍可達(dá)到465.98 g/L。

海藻糖合酶，克隆表達(dá)，定點(diǎn)突變，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化

海藻糖 (α-D-吡喃葡萄糖基-(1→1)-α-D-吡喃葡萄糖苷) 是一種安全穩(wěn)定的天然非還原性二糖[1]，廣泛存在于細(xì)菌、酵母和蘑菇等真菌、藻類、昆蟲及無脊椎動(dòng)物中[2]。海藻糖具有保濕性、抗凍抗干燥性，對(duì)酸熱高度穩(wěn)定等理化性質(zhì)和對(duì)生物大分子的非特異性保護(hù)等生物學(xué)功能[3]，可作為抗體疫苗和酶的干燥穩(wěn)定劑，抑制脂肪酸化、防腐的食品添加劑，表面活性劑以及培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物的媒介[4]等，在醫(yī)學(xué)、化妝品、食品、農(nóng)業(yè)等行業(yè)起著重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)。海藻糖的產(chǎn)量現(xiàn)狀僅能基本滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)需求，且大部分被國(guó)外壟斷，國(guó)內(nèi)的生產(chǎn)工藝、產(chǎn)量和產(chǎn)品純度等都還具有很大的提升空間。

目前海藻糖的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)主要通過以下3種酶轉(zhuǎn)化法實(shí)現(xiàn)：1) 磷酸化酶法[5-6]；2) 雙酶法——麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶[7-8]；3) 海藻糖合成酶法[9-10]。其中方法一需要消耗價(jià)格昂貴的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖，生產(chǎn)成本高，無法大規(guī)模生產(chǎn)；方法二是目前工業(yè)化運(yùn)用最多的方法之一[11]，效率遠(yuǎn)高于早期的發(fā)酵和酵母提取等方法[12]，但同時(shí)也存在著低聚糖積累、反應(yīng)成分復(fù)雜、工藝要求較高的弊端；方法三是通過海藻糖合成酶的分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷作用將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，底物專一性強(qiáng)，具有途徑簡(jiǎn)單、生產(chǎn)原料廉價(jià)、產(chǎn)物簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是酶法生產(chǎn)中最理想的工業(yè)化生產(chǎn)方法，也是一直以來的研究熱點(diǎn)。眾多不同來源的海藻糖合酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，性質(zhì)和三維結(jié)構(gòu)也被解析，不斷有學(xué)者嘗試以分子手段如定向進(jìn)化和基于結(jié)構(gòu)的定點(diǎn)誘變等方法來解決和突破海藻糖合酶穩(wěn)定性低、轉(zhuǎn)化率不高等限制實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的瓶頸[13]。其中取得顯著效果的有Chou等以已知耐高溫海藻糖合成酶序列為參考，將來源的海藻糖合酶 (PTTS) 中部分氨基酸殘基替換突變?yōu)楦彼岬玫降耐蛔凅wN503P. PTTS，海藻糖產(chǎn)量提升了1.3倍，而且在65 ℃條件下的相對(duì)活力比野生型提高了39%[14]。還有王青艷等對(duì)褐色喜熱裂孢菌海藻糖合成酶保守氨基酸殘基進(jìn)行的定點(diǎn)突變，突變酶比活力提高了1.25倍[15]。

文中將來源于天藍(lán)色鏈霉菌的海藻糖合酶基因 () 在大腸桿菌中進(jìn)行過表達(dá)，得到了重組酶ScTreS，針對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，并結(jié)合同源建模得到的海藻糖合酶預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)和多序列比對(duì)結(jié)果，對(duì)保守區(qū)和活性中心附近的一些氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，篩選得到了性能提高的突變體。進(jìn)一步對(duì)野生型和突變體的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了對(duì)比分析，同時(shí)優(yōu)化了突變體重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖的反應(yīng)條件，為海藻糖合酶的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

天藍(lán)色鏈霉菌購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。大腸桿菌BL21 (DE3) 和質(zhì)粒pET-28a由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 酶和試劑

RⅠ、d Ⅲ限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶和Ⅰ等購(gòu)自TaKaRa公司。高保真PCR酶、同源重組酶克隆試劑盒購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌 DNA 基因組提取試劑盒購(gòu)于上海捷瑞生物工程有限公司；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；麥芽糖一水合物、葡萄糖、海藻糖二水合物等其他分析純?cè)噭┚?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

天藍(lán)色鏈霉菌培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L，KNO31 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，pH 7.2–7.4。

LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。

TY培養(yǎng)基：酵母粉8.0 g/L，甘油10.0 g/L，胰蛋白胨12.0 g/L，K3PO44.02 g/L，NaCl 3 g/L，一水合檸檬酸2.1 g/L，檸檬酸鐵銨0.3 g/L， (NH4)2SO42.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 基因提取和引物設(shè)計(jì)

天藍(lán)色鏈霉菌基因組的提取按照細(xì)菌基因組提取試劑盒的方法完成。

通過對(duì)NCBI上已有的鏈霉菌來源的海藻糖合酶基因進(jìn)行多序列比對(duì)，設(shè)計(jì)并合成同源臂引物ScT-F與ScT-R，序列參見表1。

1.2.2 基因的克隆和重組表達(dá)載體構(gòu)建

以提取的基因組為模板，使用引物ScT-F和ScT-R擴(kuò)增，將純化得到的PCR產(chǎn)物與用RⅠ和d Ⅲ酶切回收的pET28a載體以一定比例混合用同源重組試劑盒進(jìn)行連接。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，在LB固體平板培養(yǎng)，菌落PCR篩選鑒定后挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并提取得到重組質(zhì)粒pET28a-ScTreS送至上海瑞迪生物科技有限公司測(cè)序，驗(yàn)證是否成功構(gòu)建重組菌株。

表1 本研究中使用的引物

The italic sequences are the homologous arm and the underlined sequences are the mutated sites.

1.2.3 突變位點(diǎn)的選擇和突變體的構(gòu)建

根據(jù)海藻糖合酶氨基酸序列，采用http://swiss model.expasy.org網(wǎng)站服務(wù)器進(jìn)行海藻糖合酶三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，并與不同來源的海藻糖合酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。本著以側(cè)鏈最短且不帶電荷的丙氨酸或其他相應(yīng)關(guān)鍵氨基酸殘基替換的原則，分別選擇L76、Q125、A165、T169、F178、F179、D188、K246、E331、E340、I361位點(diǎn)進(jìn)行突變。突變引物參見表1。

定點(diǎn)突變選擇以大引物PCR定點(diǎn)突變的方法[16-18]進(jìn)行。以野生型的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-ScTreS為模板使用高保真酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。在上游引物中引入突變點(diǎn)，下游引物采用質(zhì)粒pET28a上下游的一段序列作為通用引物 (pET28a-2254-R)，第一步PCR反應(yīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物作為含有突變序列的大片段引物，在第二步PCR反應(yīng)中再次變性延伸得到含完整突變基因的全長(zhǎng)質(zhì)粒。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，5個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s；68 ℃延伸6 min，20個(gè)循環(huán)；68 ℃充分延伸12 min。反應(yīng)結(jié)束用Ⅰ消化PCR產(chǎn)物中的模板之后將其轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)。挑取菌落PCR鑒定結(jié)果陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子送上海瑞迪生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 TreS酶的表達(dá)和純化

由?40 ℃冰箱取出菌種，于固體LB平板劃線活化，挑取單菌落接入含有卡那霉素 (50 μg/mL) 抗性的10 mL LB培養(yǎng)液中。37 ℃過夜培養(yǎng)后按照1% (/) 的接種量轉(zhuǎn)接入含相同濃度抗生素的50 mL LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2–3 h，待600達(dá)到0.6–0.8時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，16 ℃過夜培養(yǎng)。離心收集菌體，用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液 (pH 7.0) 洗滌菌體并懸浮。超聲破碎(破碎1 s，間隔3 s，共破碎8–10 min)，12 000 r/min低溫離心20 min，取上清得重組菌粗酶液。

將粗酶液用0.2 μm濾膜過濾處理，通過Ni-NTA親和層析，利用不同濃度的咪唑進(jìn)行梯度洗脫獲得純化蛋白。并采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度[19-20]。

1.2.5 酶活測(cè)定

反應(yīng)體系包含100 g/L麥芽糖，50 mmol/L的pH 7.0磷酸鈉緩沖液，30 μg 純酶，35 ℃水浴保持1 h，沸水浴10 min終止反應(yīng)。使用HPLC法檢測(cè)酶活。高效液相色譜檢測(cè)條件為：RID檢測(cè)器，NH2柱 (Agilent 5 μm, 4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相為80%乙腈，流速1 mL/min，柱溫40 ℃。

酶活定義為：每1 min生成1 μmol海藻糖的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)

酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH：分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃溫度下測(cè)定海藻糖合酶的酶活，分析獲得酶的最適反應(yīng)溫度。分別在不同pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的反應(yīng)體系下測(cè)定海藻糖合酶的酶活，研究酶的最適反應(yīng)pH。

酶的熱穩(wěn)定性：取適量純酶液在35 ℃、40 ℃、45 ℃保溫一定時(shí)間后取樣檢測(cè)其殘余酶活力，考察酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.7 突變體的發(fā)酵罐培養(yǎng)及全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖

將突變體BL21/pET28a-K246A按1.2.4方法活化并轉(zhuǎn)接入50 mL LB 大瓶，培養(yǎng)5–6 h后接種至裝有2.5 L TY培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，待菌體濃度600達(dá)到18–20時(shí)，添加0.2 mmol/L的 IPTG，28 ℃高轉(zhuǎn)速誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h左右，發(fā)酵液用6 000 r/min離心30 min，去除上清，收集菌體，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化優(yōu)化反應(yīng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及重組載體構(gòu)建

提取天藍(lán)色鏈霉菌基因組作為模板PCR擴(kuò)增目的基因。按1.2.2方法構(gòu)建重組菌，并送樣基因測(cè)序得到序列，核酸大小1 701 bp (圖1A)，GenBank的Protein ID為AZQ37515.1。

2.2 突變位點(diǎn)的選擇

同源建模及利用Discovery Studio以麥芽糖為配體，進(jìn)行分子對(duì)接結(jié)果見圖2。海藻糖合成酶具有典型的 (β/α)8桶裝催化結(jié)構(gòu)域，底物結(jié)合在蛋白表面的凹槽內(nèi)，與分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷作用活性中心靠近酶表面的報(bào)道相符[21-22]。根據(jù)已有的結(jié)構(gòu)研究和分析結(jié)果，推測(cè)保守序列Ⅰ區(qū)的His121和Ⅳ區(qū)的His329介導(dǎo)底物結(jié)合，保守序列Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)形成活性中心，其中的Asp218和Glu260分別作為親核基團(tuán)和質(zhì)子供體發(fā)揮作用[23-25]。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇L76、Q125、A165、T169、F178、F179、D188、K246、E331、E340、I361等殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，按1.2.3方法構(gòu)建突變重組菌，將驗(yàn)證含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆子送往公司測(cè)序，除去部分未突變的原始菌株外，其他轉(zhuǎn)化子突變位置和氨基酸均符合預(yù)期突變。

圖1 StreptomycescoelicolorTreS基因的克隆(A)和表達(dá)及純化分析(B)

圖2 ScTreS結(jié)合底物麥芽糖的表面結(jié)構(gòu)圖(A)和底物結(jié)合位點(diǎn)、保守結(jié)構(gòu)域以及部分突變氨基酸三維結(jié)構(gòu)圖(B)

2.3 野生重組酶與突變酶的表達(dá)純化

按1.2.4的方法將取得的重組菌和突變體粗酶液用Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱純化。取少量粗酶液和純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖1B和圖3所示，含有重組質(zhì)粒 pET28a-TreS的大腸桿菌在分子量62 kDa處有明顯蛋白表達(dá)帶，所得純化酶液?jiǎn)我唬梢娫?BL21 (DE3) 中能夠正常表達(dá)。野生酶與突變酶酶活結(jié)果如表2所示，突變酶K246A與野生酶比酶活提高1.43倍；A165T和F178Y提高約1.39倍和1.18倍。已報(bào)道如谷氨酸棒桿菌、天藍(lán)色鏈霉菌(Gene ID: 8250619)、阿維鏈霉菌、灰色鏈霉菌、彎曲熱單孢菌來源的TreS酶活分別為55、56、57、60和65 U/mg[26]。可見野生型ScTreS酶活略偏低，而A165T和K246A的酶活則基本相持平或更高。另外以100 g/L的海藻糖為底物，在相同條件下反應(yīng)測(cè)得ScTreS逆向酶活為20.9 U/mg。

2.4 野生酶與突變酶的酶學(xué)性質(zhì)比較

2.4.1 野生酶與突變酶的最適溫度比較

酶在不同溫度下測(cè)得的酶活結(jié)果見圖4A，突變酶與野生酶ScTreS的最適反應(yīng)溫度并沒有發(fā)生明顯變化，都為35 ℃左右。當(dāng)溫度大于35 ℃時(shí)突變體Q125A酶活即迅速下降，而野生酶和其他突變體在40 ℃以下仍能保持較高酶活，溫度大于40 ℃時(shí)，酶活開始逐漸下降。

2.4.2 野生酶與突變酶的最適pH比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 (圖4B)，重組酶和突變酶的最適反應(yīng)pH都為7.0，野生酶和突變體K246A、A165T、F179W在pH 6.0–7.5之間始終保持大于90%的較高酶活力。酸性條件下，突變體K246A、A165T的相對(duì)酶活與野生酶對(duì)比相對(duì)較低，而在堿性條件下則相反。

2.4.3 野生酶和突變酶熱穩(wěn)定性的比較

將野生酶于35 ℃、40 ℃和 45 ℃靜置并取樣檢測(cè)酶的剩余活力，結(jié)果見圖4C。在不同溫度保持12 h后，35 ℃下酶液仍約有80%酶活，40 ℃和45 ℃條件下分別剩余約60%和45%的酶活；而在24 h后，酶液在35 ℃、40 ℃、45 ℃條件下的酶活分別下降到約62%、45%、31%；可見野生酶活力在45 ℃以下時(shí)比較穩(wěn)定，在45 ℃時(shí)則變得較差。

圖3 野生型ScTreS和突變株純化的SDS-PAGE分析

表2 重組野生型和突變體ScTreS的相對(duì)酶活

將突變酶分別置于35 ℃、40 ℃、45 ℃保持 24 h后取樣測(cè)其殘余酶活并與野生酶進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖4D，突變體的熱穩(wěn)定性與野生酶的范圍相近，僅發(fā)生了細(xì)微變化，沒有明顯的提高或降低。

2.4.4 野生酶與突變酶合成海藻糖的能力比較

取適量野生型ScTreS和突變株K246A、A165T、F178Y、F179W、Q125A純酶，在50 mmol/L磷酸鈉緩沖液 (pH 7.0)、100 g/L麥芽糖底物濃度體系下，35 ℃、150 r/min條件反應(yīng)，按時(shí)取樣進(jìn)行HPLC檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，反應(yīng)8 h時(shí)，突變株K246A海藻糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，為71.1%，比野生型提高約14%；A165T最高轉(zhuǎn)化率66.8%，相對(duì)提高約10%；F178Y相對(duì)提高約6%；F178W基本與野生酶持平；而Q125A轉(zhuǎn)化率比野生型降低約5%。

圖4 野生酶和突變酶的最適溫度(A)、最適pH (B)和溫度穩(wěn)定性(C-D)

圖5 野生型ScTreS和突變株K246A、A165T、F178Y、F179W、Q125A合成海藻糖能力的比較

2.5 海藻糖合酶突變體全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖的條件優(yōu)化

2.5.1 溫度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖的影響

溫度通過影響酶促反應(yīng)的效率而影響海藻糖的合成。控制初始反應(yīng)pH 7.0，底物濃度200 g/L，菌體量600=20，其他條件相同的情況下，分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖，結(jié)果如圖6A所示。當(dāng)反應(yīng)溫度為35 ℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，達(dá)到64.5%，同時(shí)伴隨生成12.7%的葡萄糖；在45 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化率較低，僅為50.7%，并生成12.5%的葡萄糖。

圖6 溫度(A)、pH (B)、菌體生長(zhǎng)密度(C)和底物濃度(D)對(duì)突變重組菌BL21/pET28a-K246A全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖的影響

2.5.2 初始pH對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖的影響

維持反應(yīng)溫度35 ℃，底物濃度200 g/L，菌體量600為20，其他條件相同的情況下，在初始體系pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖。pH對(duì)海藻糖制備的影響結(jié)果見圖6B，pH小于7.0時(shí)，全細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率隨pH的升高而增加，在pH 6.5和7.0時(shí)轉(zhuǎn)化率較高，分別為62.4%和65.9%，副產(chǎn)物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率分別為7.82%和9.1%；而當(dāng)pH升高到8.0時(shí)，轉(zhuǎn)化率則下降到50.7%。

2.5.3 菌體量對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖的影響

實(shí)際應(yīng)用中為了滿足生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本，將菌體濃度控制在適宜的水平也是至關(guān)重要的。控制其他條件相同，在反應(yīng)溫度35 ℃，初始pH 7.0，底物濃度200 g/L，菌體量600分別為5、10、15、20、25、30條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖。結(jié)果如圖6C，轉(zhuǎn)化體系細(xì)胞600為15時(shí)，海藻糖產(chǎn)量最高，轉(zhuǎn)化率為69.2%。

2.5.4 底物濃度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖的影響

控制反應(yīng)溫度35 ℃，初始pH 7.0，菌體量600為15，在麥芽糖濃度分別為100、200、300、400、500、600、700 g/L條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。全細(xì)胞轉(zhuǎn)化率結(jié)果如圖6D所示，并沒有表現(xiàn)出明顯的底物抑制效果，底物濃度300 g/L轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，約73.7%。當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥?00 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率也能維持在65.3%左右。

2.5.5 5 L罐全細(xì)胞轉(zhuǎn)化

用1 L pH 7.0、50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液配置的麥芽糖溶液懸浮適量BL21/pET28a-K246A菌體，使其600為15，35 ℃、200 r/min條件下于罐上轉(zhuǎn)化，液相檢測(cè)轉(zhuǎn)化液中海藻糖、麥芽糖及葡萄糖的濃度。結(jié)果如圖7所示，300 g/L底物濃度下，共生成213.93 g/L海藻糖，21.35 g/L葡萄糖，轉(zhuǎn)化率71.3%。700 g/L底物濃度下，共生成465.98 g/L海藻糖，42.73 g/L葡萄糖，轉(zhuǎn)化率66.5%。

3 討論

文中從天藍(lán)色鏈霉菌中克隆出一種新型海藻糖合酶并在大腸桿菌BL21 (DE3) 中進(jìn)行了異源表達(dá)。測(cè)得其相應(yīng)的酶學(xué)性質(zhì)參數(shù)，最適反應(yīng)溫度35 ℃，最適pH 7.0，海藻糖轉(zhuǎn)化率最高為65%。同源建模模擬得到ScTreS的三維結(jié)構(gòu)并進(jìn)行底物對(duì)接。根據(jù)序列比對(duì)的結(jié)果和對(duì)三維模型的分析，選取活性中心附近的部分氨基酸殘基進(jìn)行了定點(diǎn)突變。推測(cè)突變體L76A、D188A、E331A、Q125A、T169S、I361A和E340D影響破壞了底物結(jié)合位點(diǎn)和催化中心，導(dǎo)致酶完全失活或降低；A165和F178分別位于底物結(jié)合的凹槽的正上方,突變后表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使底物更容易進(jìn)入到酶的活性中心，所以比酶活得到了提高，海藻糖轉(zhuǎn)化率也提高了10%和6%；而K246在保守序列Ⅱ區(qū)、Ⅲ區(qū)對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)后的第4個(gè)α螺旋的轉(zhuǎn)角，突變?yōu)楸彼岷螅傅氖杷栽黾樱孜锏拇呋Y(jié)構(gòu)域也發(fā)生細(xì)微變化，對(duì)酶活力產(chǎn)生了影響，使得海藻糖轉(zhuǎn)化率提高了14%。對(duì)此還需要進(jìn)一步的飽和突變以及晶體結(jié)構(gòu)的研究分析來進(jìn)行佐證。

酶法催化比全細(xì)胞催化對(duì)反應(yīng)條件更加敏感，容易失活，而全細(xì)胞催化更穩(wěn)定，可重復(fù)利用率高，文中的全細(xì)胞重復(fù)利用3次后海藻糖產(chǎn)量仍有54.7%，另外全細(xì)胞催化不僅在反應(yīng)過程中會(huì)消耗一部分葡萄糖副產(chǎn)物，有利于后期海藻糖的分離純化；而且省去了酶法催化前期所需破碎細(xì)胞的過程，工藝流程更簡(jiǎn)便優(yōu)化，經(jīng)濟(jì)效益更高。所以為了契合實(shí)際生產(chǎn)，本研究對(duì)利用突變株BL21/pET28a-K246A全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖的反應(yīng)條件也進(jìn)行了探索優(yōu)化。結(jié)果表明在溫度35 ℃、pH 7.0、底物濃度300 g/L的最適條件下，海藻糖轉(zhuǎn)化率為73.7%；改變底物濃度，轉(zhuǎn)化率也基本大于63%，在高濃度底物700 g/L時(shí)的轉(zhuǎn)化率分別為66%，符合目前已報(bào)道和實(shí)際應(yīng)用的最高水平[27]，與經(jīng)過透性化等工藝處理的細(xì)胞海藻糖轉(zhuǎn)化率水平相比，轉(zhuǎn)化率相近或更高，在效率和生產(chǎn)工藝上都更有優(yōu)勢(shì)。綜上所述，文中所構(gòu)建的天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶和突變株及其相關(guān)研究結(jié)果為海藻糖合成酶生產(chǎn)海藻糖的工業(yè)化應(yīng)用進(jìn)一步奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Heterologous expression of Streptomyces coelicolor trehalose synthase and whole-cell biocatalyst production of trehalose in Escherichia coli

Ao Wu, Xian Zhang, Meijuan Xu, Taowei Yang, Huazhong Li, and Zhiming Rao

Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China

The trehalose synthase () gene fromwas successfullycloned and heterologously expressed inBL21(DE3). The protein purified by Ni-NTA affinity column showed an apparent molecular weight (MW) of 62.3 kDa analyzed by SDS-PAGE. The optimum temperature of the enzyme was 35 °C and the optimum pH was 7.0; the enzyme was sensitive to acidic conditions. By homologous modeling and sequence alignment, the enzyme was modified by site-directed mutagenesis. The relative activities of the mutant enzymes K246A and A165T were 1.43 and 1.39 times that of the wild type, an increased conversion rate of 14% and 10% respectively. To optimize the synthesis conditions of trehalose, the mutant strain K246A was cultivated in a 5-L fermentor and used for whole-cell transformation. The results showed that with the substrate maltose concentration of 300 g/L at 35 °C and pH 7.0, the highest conversion rate reached 71.3%, and the yield of trehalose was 213.93 g/L. However, when maltose concentration was increased to 700 g/L, the yield of trehalose can reach 465.98 g/L with a conversion rate of 66%.

trehalose synthase, clone and expression, site-directed mutagenesis, whole-cell conversion

January 19, 2019;

March 13, 2019

Foundamental Research Funds for the Central Universities (No. JUSRP51708A), the Project Funded by the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions, Top-notch Academic Programs Project of Jiangsu Higher Education Institutions.

s: Huazhong Li. E-mail: hzhli@jiangnan.edu.cn Zhiming Rao. Tel: +86-510-85916881; E-mail: raozhm@jiangnan.edu.cn

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 (No. JUSRP51708A)，江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程，江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目資助。

2019-06-10

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190610.1002.001.html

吳傲, 張顯, 徐美娟, 等. 天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合酶的異源表達(dá)、活性分析及重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成海藻糖的條件優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(7): 1348–1358.

Wu A, Zhang X, Xu MJ, et al. Heterologous expression oftrehalose synthase and whole-cell biocatalyst production of trehalose in. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1348–1358.

(本文責(zé)編 郝麗芳)