發酵乳桿菌多銅氧化酶的異源表達及酶學性質

徐潔，方芳,2

發酵乳桿菌多銅氧化酶的異源表達及酶學性質

徐潔1，方芳1,2

1 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122

生物胺是一種存在于發酵食品中的含氮小分子有機化合物，過量攝入可能引起過敏或其他不良反應。利用酶法降解是減少發酵食品中生物胺含量從而保障食品安全的有效方法之一。文中成功克隆了來源于發酵乳桿菌的多銅氧化酶基因，在大腸桿菌中表達的酶活水平為484 U/L。通過鎳柱親和層析方法獲得了此多銅氧化酶的純酶。該多銅氧化酶的最適反應溫度為50 ℃，最適反應pH為3.5，其m為1.3 mmol/L，max為7.67×10–2mmol/(L?min)。對酶的應用特性研究表明，來源于發酵乳桿菌的多銅氧化酶對18% (/) NaCl有一定的耐受性，并可降解包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺和亞精胺在內的7種生物胺。其中它對組胺和酪胺的降解能力最高，分別為51.6%和40.9%。此外，該酶對醬油中的生物胺也有普遍降解作用，使用較低酶量(500 U/L) 時，對醬油中總胺的降解率達到10.6%。多銅氧化酶具備降解發酵食品中生物胺的潛力，為進一步實現這類食品酶的實際應用奠定基礎。

多銅氧化酶，生物胺，克隆表達，酶學性質，發酵乳桿菌

生物胺(Biogenic amines, BAs)是生物體內產生的一類低分子量含氮有機化合物的總稱，是合成核酸、蛋白質、生物堿等的前體物質[1]。人體自身合成的生物胺可促進正常生理活動，而通過食物攝入過量生物胺會引起頭疼、心悸、腹瀉嘔吐等不良反應，嚴重時可能危及生命[2-4]。生物胺的潛在毒性作用對人體健康構成的危害不容小覷，而發酵食品與發酵酒精飲料中普遍存在生物胺，因此應采取有效措施進行控制和減少[5-7]。

目前用于控制和減少發酵產品中的生物胺的方法，主要有對生產原料進行優化、減少發酵體系中產生物胺的微生物以及酶法降解這三種。前兩種方法對加工設備的要求較高，很大可能會影響產品的風味，因此在實際生產中使用時存在一定的局限性[8]。利用酶法降解生物胺，基本不影響發酵食品生產工藝，對食品營養和風味的影響也較小[9-11]。已報道的可以降解生物胺的酶有胺氧化酶(Amine oxidases, AOs)、組胺脫氫酶(Histamine dehydrogenase, HADH) 和多銅氧化酶(Multicopper oxidase, MCO)[12-14]。胺氧化酶和組胺脫氫酶只特異性作用于某個或某幾個生物胺，它們的活性也分別受乙醇和羰基化合物的抑制，且最適pH多為中性，因此這兩類酶的實際應用還存在較多問題[15]。多銅氧化酶催化生物胺氧化生成對應的醛、氨和水，從而達到分解生物胺的效果[16-19]。雖然現在已報道的多銅氧化酶能降解一種或多種生物胺[9,20-21]，但是尚缺少對這些多銅氧化酶酶學性質和應用特性的深入研究。

因此，尋找可用于降解發酵食品中生物胺的多銅氧化酶并對其酶學和應用特性進行研究，對于建立發酵食品中生物胺的酶法減控方法具有重要的意義。本研究旨在篩選獲得具有降解生物胺能力的多銅氧化酶，并對其最適反應pH、溫度等酶學性質及酶降解生物胺的能力進行探究。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

本研究所用細菌菌株以及質粒均為本實驗室保藏(表1)。

1.2 試劑及儀器

試劑：1,7-二氨基庚烷、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、質粒提取試劑盒購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；生物胺標準品購自美國Sigma公司；限制性內切酶、DNA 聚合酶、DNA連接酶均為TaKaRa產品，其他試劑為分析純試劑。

儀器：Gel Doc凝膠成像系統以及AKTA蛋白純化儀購自美國Bio-Rad公司；安捷倫1260高效液相色譜(HPLC) 購自美國安捷倫公司。

1.3 產生物胺降解酶菌株的篩選

將分離自各類發酵食品中的6株細菌在MRS培養基中37 ℃靜置培養20 h后，8 000 r/min離心10 min收集菌體并用無菌生理鹽水洗滌菌體2次。將菌體以108CFU/mL的濃度與醬油混勻37 ℃靜置反應24 h。然后10 000 r/min離心5 min后取上清液，用HPLC測定生物胺的含量，比較各菌株的降解生物胺能力[22]。

表1 本研究所用質粒和菌株

1.4 多銅氧化酶的克隆表達與純化

1.4.1 表達多銅氧化酶重組菌的構建

以發酵乳桿菌基因組為模板，用引物MCOF/MCOR (MCOF: 5?-CCGGAATTCATGAAA ACCTATACGGACTATTTC-3?; MCOR: 5?-CCCAA GCTTTTAGTGGTGGTGGTGATGATGCATTTTC>ATCCCCATTT-3?) 擴增其多銅氧化酶基因，PCR產物和質粒pET28a均用RⅠ和d Ⅲ進行雙酶切和連接后，轉化大腸桿菌JM109。提取含有正確序列轉化子的重組質粒，轉化大腸桿菌BL21，構建的表達多銅氧化酶的重組菌命名為BL21- pET28a-MCO。

1.4.2 重組多銅氧化酶的表達與純化

重組菌用LB培養基(含50 mg/L卡那霉素) 37 ℃、220 r/min培養過夜。然后按1% () 轉接至TB培養基 (含50 mg/L卡那霉素)，37 ℃、220 r/min培養至600為 0.6?0.8，加入1 mmol/L的Cu2+和0.1 mmol/L IPTG，在20 ℃培養20 h。

菌液于4 ℃、8 000 r/min離心5 min后收集菌體，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 PBS (pH 7.4)洗滌菌體2次后重懸菌體，再進行超聲破碎。離心(4 ℃，12 000 r/min，20 min) 收集上清制得多銅氧化酶粗酶液。重組多銅氧化酶的純化采用鎳柱純化，用0.5 mol/L咪唑溶液(pH 7.4) 進行梯度洗脫，收集有活性的組分進行脫鹽處理后用于后續分析和研究。

1.5 多銅氧化酶活力測定

采用可見光吸收法測定多銅氧化酶活力[20]：即以2,2?-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 為底物，通過檢測酶氧化ABTS的量計算多銅氧化酶酶活。反應時間為2 min，反應體系為100 μL酶液、2.9 mL含0.5 mmol/L ABTS和1 mmol/L CuCl2的檸檬酸鈉緩沖液。將每分鐘氧化1 μmol ABTS所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。酶活計算公式如下所示：

式中：ε為ABTS在420 nm下的摩爾吸光系數，ε=3.6×104L/(mol?cm)；Δ為反應時間(min)；Δ為420 nm處吸光度的變化值；1為反應總體積(mL)；2為酶量(100 μL)。

1.6 重組多銅氧化酶酶學性質研究

1.6.1 重組酶的最適反應溫度及pH

測定酶的最適反應溫度和pH時，除了反應溫度和pH外，其他條件與測定多銅氧化酶酶活的反應條件相同。考察溫度為25?70 ℃，pH為2.5?5.0 (50 mmol/L乙酸鈉緩沖液)，5.5?7.0 (50 mmol/L PBS緩沖液)，7.5?8.5 (50 mmol/L Tris-HCl緩沖液)。

1.6.2 金屬離子和鹽對重組多銅氧化酶酶活的影響

金屬離子對酶活的影響：將酶液與1 mmol/L的金屬離子緩沖液混合，保溫10 min后測定酶活力，以未加金屬離子的為對照。

NaCl對重組多銅氧化酶穩定性的影響：將酶液在含有10%、15%、18%和20% (/) 的NaCl緩沖液中放置1 h后測定酶活力，以未加NaCl的為對照。

1.6.3 酶反應動力學參數測定

在最適反應條件下，分別測定體系中含有0.1?1.0 mmol/L ABTS時的酶活，根據Lineweaver- Burk雙倒數作圖法計算得到重組多銅氧化酶的m、max值。

1.6.4 重組多銅氧化酶對單個生物胺的降解能力分析

將100 U/L多銅氧化酶分別與濃度為50 mg/L的組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、苯乙胺、精胺和亞精胺溶液混合，于37 ℃靜置48 h后測定生物胺的含量，對照組為不加酶的生物胺溶液，分析重組多銅氧化酶對不同底物的降解能力。

1.7 重組多銅氧化酶對混合生物胺的降解

將500 U/L多銅氧化酶分別加入生物胺溶液和市售醬油中，于37 ℃靜置24 h后測定生物胺的含量，對照組為不加酶的生物胺溶液或市售醬油。生物胺溶液中各生物胺的濃度依據市售醬油中生物胺含量配置，其組成為：色胺20 mg/L，腐胺、尸胺和亞精胺50 mg/L，苯乙胺150 mg/L，組胺和酪胺200 mg/L。

2 結果與分析

2.1 降生物胺菌株的選擇

為了篩選一種可以用于降解發酵食品中生物胺的酶，本研究考察了6株來源于發酵食品的細菌降解醬油中生物胺的能力。由圖1可以看出，發酵乳桿菌對總胺的降解率最高，為16.1%；此外，它對酪胺、組胺的降解作用最強，降解率分別為23.0%和10.0%。發酵食品中酪胺和組胺含量相對比較高，而且組胺由于其危害性較大是食品中限量規定的代表性生物胺[23]。在考察的6株細菌中，發酵乳桿菌是最具降解發酵食品中生物胺潛力的菌株。因此，選擇它用于生物胺降解酶的相關研究。

2.2 多銅氧化酶的異源表達與純化

通過在NCBI數據庫中尋找發酵乳桿菌基因組中編碼多銅氧化酶基因的同源序列，設計了用于擴增的引物(MCOR和MCOF)。以發酵乳桿菌Y29基因組DNA為模板，成功擴增了發酵乳桿菌Y29基因組中編碼多銅氧化酶的基因(圖2)。將此PCR產物與載體pET28a經酶切連接后，轉化大腸桿菌，成功構建了表達重組多銅氧化酶的.BL21 pET28a-MCO。

圖1 菌株降解醬油中生物胺能力的比較

圖2發酵乳桿菌Y29中編碼多銅氧化酶基因的擴增

重組菌.BL21 pET28a-MCO表達重組多銅氧化酶的情況見圖3A。經測定，重組多銅氧化酶在大腸桿菌中的表達水平為484 U/L，其分子量約為58 kDa。將此粗酶液通過鎳柱親和層析，得到了重組多銅氧化酶純酶(圖3B)。

2.3 MCO的酶學性質研究

2.3.1 多銅氧化酶的最適反應pH及溫度

通過考察發現，重組多銅氧化酶的最適反應pH為3.5，當反應pH為3.0–4.5時，酶的活性大于50% (圖4A)。該重組多銅氧化酶的最適反應pH值與植物乳桿菌來源的多銅氧化酶相同[21]，而來源于地衣芽孢桿菌和假單胞菌sp. 593的多銅氧化酶最適反應pH則略高[24-25]。對來源于發酵乳桿菌的MCO的最適反應pH研究表明，該MCO為酸性酶，因此具有應用于發酵食品的潛力。

圖3 重組多銅氧化酶的表達與純化

由圖4B可知，重組多銅氧化酶的最適反應溫度為50 ℃，50 ℃時重組酶的活性是30 ℃時的1.7倍。

2.3.2 金屬離子和鹽對多銅氧化酶酶活的影響

由于金屬離子與多銅氧化酶的催化氧化反應之間有一定關系，因此本研究考察了金屬離子對重組多銅氧化酶酶活的影響。由圖5A可知，Cu2+、Ni2+和Mg2+對重組多銅氧化酶均有激活作用，其中Cu2+對重組多銅氧化酶的激活作用最大，使酶活提高了1.89倍。Cu2+對重組多銅氧化酶的激活作用，可能與多銅氧化酶含有4個銅離子結合位點相關[26]。Mn2+、Zn2+和Fe2+對酶有抑制作用，Fe2+對酶活的抑制作用最明顯，在其存在下酶活僅為對照的57.7%。

圖4 重組多銅氧化酶的最適反應pH和溫度

Fig. 4 Detection of the optimal pH (A) and temperature (B) of the recombinant MCO for enzymatic reaction.

醬油是一個高鹽食品體系，NaCl濃度約為18% ()。考察多銅氧化酶對鹽的耐受性，有助于為該酶在高鹽發酵食品中的應用提供參考。由圖5B可以看出，重組多銅氧化酶在NaCl存在的條件下，酶活均受到一定程度的抑制，但在18% () NaCl中其活性仍有39.3%。該重組酶與漆酶同屬于多銅氧化酶家族，漆酶在低pH環境中酶活受到陰離子的抑制同時可以被NaCl激活，因此10%與15%的NaCl對酶活的抑制高于18%的NaCl，可能與pH和NaCl對酶的協同作用相關[27-29]。

2.3.3 多銅氧化酶反應動力學參數測定

以ABTS為底物，通過測定最適反應條件下反應體系中含有不同濃度底物時的酶活性，得到用于分析MCO酶反應動力學參數的Lineweaver-Burk雙倒數圖(圖6)。由圖6求得的重組發酵乳桿菌MCO的m值為1.3 mmol/L，max為7.67×10–2mmol/(L?min)。該重組多銅氧化酶的m低于克雷白氏桿菌sp.來源的多銅氧化酶(m=5.63 mmol/(L·min))[26]，略高于蒼白桿菌sp.來源的多銅氧化酶(m=0.072 mmol/(L·min))[30]。

2.4 多銅氧化酶對單個生物胺的降解能力

為研究重組多銅氧化酶可降解生物胺的種類和能力，考察了重組多銅氧化酶對單個生物胺的降解情況。由圖7可以看出，除精胺外，重組多銅氧化酶對考察的8種生物胺中的7種生物胺均有降解效果。其中對組胺、酪胺、腐胺、亞精胺的降解效果最顯著，分別降低了51.6%、40.9%、40.7%和38.2%。與來源于植物乳桿菌的多銅氧化酶和來源于金黃節桿菌的胺氧化酶相比[13]，該重組酶降解組胺、酪胺的能力高，且降解譜廣。

圖6 雙倒數作圖法測定MCO酶反應動力學參數

圖7 重組多銅氧化酶對單個生物胺的降解

2.5 多銅氧化酶降解生物胺特性研究

為進一步揭示來源于發酵乳桿菌Y29的多銅氧化酶降解生物胺的能力，考察了其在對混合生物胺溶液(根據市售醬油中各類生物胺的含量范圍配置，生物胺總量為 (720±15 mg/L) 和市售醬油中生物胺的降解效果。在混合生物胺體系中，多銅氧化酶可以降解除精胺外的色胺、尸胺、苯乙胺、腐胺、酪胺、亞精胺和組胺7種生物胺，其中對組胺的降解率最高，達到81.5%，對總胺的降解率為41.7% (圖8A)。與來源于J16和乳酸片球菌CECT 5930的多銅氧化酶相比，該重組酶降解組胺的能力高，且降解譜廣，來源于J16的多銅氧化酶對組胺的降解率為36%且僅能降解3種生物胺，來源于CECT 5930的多銅氧化酶不能降解組胺且僅能降解酪胺這一種生物胺[21,31]。由圖8B可以看出，本研究所用市售醬油中生物胺總量為881±13 mg/L，多銅氧化酶在此體系中可以降解除精胺外的7種生物胺，它對組胺和酪胺的降解效果較好，降解率分別為11.3%和6.8%，對總胺的降解率為10.6% (圖8B)。目前尚未有關于重組多銅氧化酶應用于醬油降解生物胺的報道，但Rosa Guarcell等的研究表明CB9CT、副干酪乳桿菌CACIO6CT、戊糖片球菌M1能降解奶酪中生物胺都與其含有多銅氧化酶相關，因此本研究的重組多銅氧化酶具備降解發酵食品中生物胺的應用潛力[32]。

圖8 重組多銅氧化酶對混合生物胺和醬油中生物胺的降解

3 結論

利用生物酶法減少發酵食品中的生物胺是目前控制食品中生物胺最有前景的途徑。但目前用于降解生物胺的酶種類少、降解譜窄、降解率低，尚不能滿足實際應用的需求。本研究通過分析來源于發酵乳桿菌的多銅氧化酶的酶學性質以及降解生物胺能力發現，該重組多銅氧化酶可降解包括色胺、尸胺、苯乙胺、腐胺、酪胺、亞精胺和組胺在內的7種生物胺，并且可顯著降低醬油中含量最高的兩種生物胺[33]——組胺和酪胺。此重組多銅氧化酶為酸性酶，對18%的NaCl有一定的耐受性，在高溫50 ℃時酶的催化活性顯著提高。此外，該多銅氧化酶具有降解醬油中生物胺的能力，對總胺降解率達到了10.6%。本研究初步評估了來源于發酵乳桿菌的多銅氧化酶在發酵食品體系中降解生物胺的能力，今后通過構建酶的食品級表達體系以及優化提高酶的表達水平，有望進一步挖掘多銅氧化酶在降解發酵食品中生物胺的應用潛力，為進一步實現這類食品酶的實際應用奠定基礎。

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Expression and characterization of a multicopper oxidase from Lactobacillus fermentum

Jie Xu1, and Fang Fang1,2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Biogenic amines (BAs) are low molecular weight organic compounds that present in fermented foods. Large amount of ingested biogenic amines can cause allergy or significant symptoms. Reduction of BAs by enzymatic reaction in fermented foods is one of the most efficient methods for removal of biohazard compounds and assurance food safety. In this study, the multicopper oxidase (MCO) gene in the genome ofwas successfully cloned inBL21 and expressed at 484 U/L. The recombinant MCO was purified by the immobilized metal affinity chromatography method. The optimal reaction temperature and pH for this enzyme was detected to be 50 °C and 3.5. Themandmaxvalues of the recombinant MCO was determined to be 1.30 mmol/L and 7.67×10-2mmol/(L·min). Moreover, this MCO dramatically degrades histamine and tyramine by 51.6% and 40.9%, and can degrade other BAs including tryptamine, phenylethylamine, putrescine, cadaverine and spermidine, and was found to be tolerant to 18% (/) NaCl. The recombinant MCO is also capable of degrading BAs in soy sauce. The degradation rate of total BAs in soy sauce reaches 10.6% though a relatively low level of enzyme (500 U/L) is used. Multicopper oxidase has the potential to degrade biogenic amines in fermented foods, which lays a foundation for the further application of this kind of food enzymes.

multicopper oxidase, biogenic amines, cloning and expression, enzymatic properties,

December 24, 2018;

February 9, 2019

National Key R&D Program of China (No. 2018YFC1604102), National Natural Science Foundation of China (No. 31771955),National First-class Discipline Program of Light Industry Technology and Engineering (No. LITE2018-08).

Fang Fang. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: ffang@jiangnan.edu.cn

國家重點研發計劃項目 (No. 2018YFC1604102)，國家自然科學基金(No. 31771955)，國家輕工技術與工程一流學科自主課題(No. LITE2018-08)資助。

徐潔, 方芳. 發酵乳桿菌多銅氧化酶的異源表達及酶學性質. 生物工程學報, 2019, 35(7): 1286–1294.

Xu J, Fang F. Expression and characterization of a multicopper oxidase from. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1286–1294.

(本文責編 陳宏宇)