柚皮素合成關鍵基因表達水平對目標產物積累水平的量化影響

焦亭亭，周景文，徐沙

柚皮素合成關鍵基因表達水平對目標產物積累水平的量化影響

焦亭亭1,2，周景文1,2，徐沙1,2

1 江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122

柚皮素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、預防動脈粥樣硬化等多種藥理活性，也是其他黃酮類化合物合成的重要前體，具有重要的應用價值。目前，微生物法生產柚皮素等黃酮類化合物由于代謝通路不平衡等原因導致產量較低，在很大程度上限制了其工業應用。文中以一株產柚皮素的釀酒酵母菌株Y-01為研究對象，利用啟動子和拷貝數控制柚皮素合成代謝途徑關鍵酶4-香豆酸：CoA連接酶(4CL)、查爾酮合成酶(CHS) 和查爾酮異構酶(CHI) 編碼基因的表達水平，考察這些基因的表達水平對目標產物積累水平的量化影響。結果表明，柚皮素產量與4CL或CHI編碼基因的表達量之間關聯性較低，而與基因的表達量存在顯著的正相關性。通過調控基因的表達水平，獲得一株高產柚皮素的釀酒酵母工程菌株Y-04，產量較出發菌株Y-01提高了4.1倍。研究結果表明，CHS是柚皮素合成過程的關鍵調控靶點，合理調控CHS表達可以顯著促進釀酒酵母積累柚皮素。相關結果為采用代謝工程強化微生物合成柚皮素等重要黃酮類化合物提供了重要的理論參考。

柚皮素，表達量，關鍵基因，啟動子，拷貝數

柚皮素 (4?,5,7-三羥基二氫黃酮) 是一種重要的二氫黃酮類化合物。柚皮素及其衍生物普遍存在于高等植物中，例如西紅柿和柑橘類水果。藥理研究表明，柚皮素及其衍生物具有抗炎、抗氧化、抗病毒、預防動脈粥樣硬化等各種活性[1]。此外，柚皮素也是大多數黃酮類化合物的合成前體，可以用于合成具有更多生理活性和應用價值的重要黃酮類化合物。目前，國內外報道的柚皮素制備方法主要有植物提取法、化學合成法和微生物法。由于植物提取法存在植物生長周期長、含量低、代謝產物復雜等問題，導致成本較高，嚴重阻礙了柚皮素的研究和應用[2-3]。化學合成法涉及有毒化學品和極端反應條件，除成本較高外，還無法保證關鍵手性基團的天然等同性[4]。由于微生物法生產黃酮不受季節限制，具有完全的天然等同性等特點，是目前被認為最有前景的發展方向。

柚皮素的生物合成途徑從芳香族氨基酸開始，主要由4種酶參與，即酪氨酸解氨酶 (TAL) /苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、4-香豆酸∶CoA連接酶 (4CL)、查爾酮合成酶 (CHS) 和查爾酮異構酶 (CHI)。其中，TAL將L-酪氨酸轉化為對香豆酸；4CL催化1分子CoA和1分子對香豆酸形成對香豆酰輔酶A；CHS負責將3分子丙二酰輔酶A和1分子對香豆酰輔酶A轉化為柚皮素查爾酮；CHI催化柚皮素查爾酮異構化為柚皮素。為了提高目標產物的產量，研究人員首先關注于篩選高活性酶和改善酶的性質并獲得了一系列具有較高催化活性的酶[5-6]。大量的代謝工程實例表明，高效的黃酮生物合成途徑還需要調節高活性酶的表達水平。目前，基于不同強度啟動子和不同拷貝數的模塊化優化策略已經用于平衡代謝流，并顯著強化了生松素[7]和柚皮素[8]等黃酮類物質的積累。但是，該策略需要篩選具有梯度強度的啟動子文庫，并且在多基因途徑中這些啟動子的天文數目組合在實際操作中是一個巨大的挑戰。因此，在構建平衡途徑的啟動子-關鍵基因組合之前，探究途徑中目標物質產量與關鍵酶編碼基因表達量的關系是必要的。為此，文中以一株可以積累柚皮素的釀酒酵母Y-01為研究對象，利用不同強度啟動子和整合位點，梯度過量表達酶活較高香芹菜4CL、矮牽牛CHS和紫苜宿CHI[8]，結合實時熒光定量PCR (RT-PCR) 方法檢測它們的表達水平，獲得柚皮素產量與這3個關鍵酶表達量之間的關系。結果表明，CHS是黃酮合成過程的關鍵調控靶點，合理調控CHS表達有利于酵母中柚皮素的積累。研究結果對后續代謝工程強化微生物合成柚皮素等重要黃酮類化合物具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌JM109用于質粒構建和保存。釀酒酵母Y-01用于整合片段及表達，釀酒酵母S288C用于基因擴增。文中使用的主要菌株如表1所示。

表1 本研究所用的主要菌株

from,from,from

1.1.2 培養基

LB (Luria Broth) 液體培養基 (/L)：10 g NaCl，10 g蛋白胨，5 g酵母提取物，pH 7.0。

YNB (Yeast Nitrogen Base) 培養基 (/L)：200 g/L葡萄糖母液100 mL，67.4 g/L YNB (Yeast nitrogen base without amino acids) 母液100 mL，并添加所需的缺陷氨基酸 (Trp、His、Leu) 各10 mL，終濃度均為50 mg/L，加蒸餾水至1 L，過濾除菌，4 ℃冰箱保存。

YPSe培養基 (/L)：20 g蛋白胨，10 g酵母提取物，10 g蔗糖，10 mL無水乙醇。

1.1.3 主要試劑

各種抗生素和氨基酸，包括氨芐青霉素、遺傳霉素、色氨酸、組氨酸、亮氨酸，均購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。柚皮素標樣購自Sigma-Aldrich公司。蛋白胨、酵母提取物購自Oxoid公司。乙腈 (質譜純) 購自Merck公司。其他本實驗中使用的各種分析化學試劑如無特別說明均購自上海國藥集團。各種一步克隆酶、連接酶、感受態制備試劑盒、pMD19-T Simple Vector購自大連寶生物 (TaKaRa) 有限公司。細菌質粒小量提取試劑盒購自于生工生物工程 (上海) 股份有限公司。膠回收試劑盒購自Fermentas公司。引物合成以及DNA測序服務均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司提供。

1.1.4 搖瓶培養條件

從平板上挑取改造后產柚皮素釀酒酵母的單菌落，在含有20 mL YNB培養基 (添加Trp和Leu) 的250 mL搖瓶中于30 ℃、220 r/min培養18 h。然后以10% (/) 的接種量轉接到20 mL YPSe發酵培養基中，同時加入10 g/L CaCO3及終濃度500 mg/L對香豆酸，于30 ℃、220 r/min培養84 h。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母基因組整合框構建

為了使代謝途徑基因協同表達，首先確定代謝途徑關鍵基因過量表達對產物柚皮素含量的影響。選擇6個不同強度的啟動子 (P、P、P、P、P、P) 分別表達、、基因，并選取了基因組上LEU2和核糖體DNA (rDNA) 作為整合位點。啟動子P、P、P、P通過實驗室原有質粒為模板擴增獲得，P、P和基因整合的上下游同源臂 (上下游同源臂各500–1 000 bp) 以S288C基因組為模板擴增得到，以HIS5作為營養缺陷標簽。先將上下游同源臂、HIS5標簽盒通過同源重組連接在T載上，在實驗室已有質粒pY26-P--P--P-、pY26-P--P-- P-、pY26-P--P--P-上分別擴增P--T、P--T和P--T片段，通過同源重組的方法得到質粒T- LEU2up-P--T-HIS5-LEU2down、T-LEU2up- P--T-HIS5-LEU2down、T-LEU2up-P--T-HIS5-LEU2down、T-25Sup-P--T- HIS5-5Sdown、T-25Sup-P--T-HIS5- 5Sdown、T-25Sup-P--T-HIS5-5Sdown，然后分別將另外5個啟動子與這6個質粒中啟動子P通過同源重組的方法替換，得到另外30個質粒。再通過引物Pf_LEU2和Pr_LEU2分別擴增3個基因在LEU2位點上的整合片段，引物Pf_25S和Pr_5S分別擴增3個基因在rDNA區域的整合片段。文中所用主要引物見表2。

采用醋酸鋰轉化法將這36個片段分別整合到菌株Y-01的基因組上，用YNB培養基 (添加Trp和Leu) 篩選，30 ℃恒溫培養3–4 d至長出單菌落。挑取單菌落至YNB液體篩選培養基中培養24 h，13 500 r/min離心5 min去上清，收集菌體提取釀酒酵母基因組，進行PCR驗證，得到與實際大小相符的特異性條帶，則證明菌株構建成功。

1.2.2 基因轉錄水平的測定

取發酵液中培養至對數中期的釀酒酵母細胞，采用熱酚法提取總RNA[9]。利用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒 (TaKaRa) 去除總RNA中的基因組DNA后，將總RNA反轉錄成cDNA。使用TB Green? Premix Ex? Ⅱ試劑盒處理樣品，在LightCycler 480Ⅱ熱循環儀系統 (Roche，Mannheim，Germany) 上進行定量PCR (qPCR) 測定。以基因作為內參基因，用引物Pf_Actin和Pr_Actin進行qPCR值的歸一化。、和分別用引物Pf_4CL/Pr_4CL、Pf_CHS/Pr_CHS和Pf_CHI/Pr_CHI進行擴增。最后采用2?ΔΔCt方法[10]獲得、和的mRNA表達水平來表征它們的相對表達量。

表2 本研究中所用的主要引物

1.2.3 基因整合拷貝數的測定

酵母基因組DNA的提取按照Thermo公司GeneJET Genomic DNA Purification Kit中酵母基因組DNA提取說明書進行操作。

以前的研究表明在不同條件下外源基因在基因組上單拷貝克隆具有遺傳穩定性[11-12]，而很少有研究能夠確定多拷貝克隆的遺傳穩定性。由于一株菌株中多拷貝克隆位點起源于同一基因座處的多個同源重組事件，外源基因通常在基因組上串聯重復可能導致整合基因的不穩定[13]。為了確定基因、和整合到酵母rDNA區域菌株的遺傳穩定性，將以rDNA為整合位點的所有釀酒酵母重組菌株在YNB缺陷型平板上劃線，培養3–4 d至長出單菌落，挑取單菌落至20 mL新鮮的液體YNB缺陷型培養基中，30 ℃、220 r/min培養24 h，然后按1%接種量轉移到新鮮的20 mL YPD中并在相同條件下溫育24 h。該過程再重復5次，總生長時間為144 h，即傳代72代。

從原始的非傳代菌株和傳代72次菌株中提取基因組DNA，通過qPCR檢測基因組中關鍵酶的整合拷貝數。對帶有目的基因、和的T載體分別進行梯度稀釋，制備目的基因質粒的標準曲線，取基因組DNA各1 μL為模板，用熒光引物對目的基因進行qPCR，將得到的t值代入標準曲線中，求出DNA樣品中起始模板的拷貝數。利用相同的方法計算看家基因(編碼葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶，在基因組以單拷貝的形式存在) 的起始模板的拷貝數。因為在表達菌株中都導入了質粒pY26-P--P--P-，因此要除去質粒中目的基因的拷貝數。利用上述同樣的方法制作該質粒的標準曲線，以質粒中作為目標基因。因此，基因組中關鍵酶的整合拷貝數計算公式為：N=(N1?N2)/N0+1(N1代表基因組中目的基因的起始模板的拷貝數，N2代表基因組中基因起始模板的拷貝數，N0代表基因組中看家基因起始模板的拷貝數，1代表基因組染色體上原有一個拷貝數)。

1.2.4 柚皮素的提取與檢測

發酵結束后，收集發酵液并加入同體積的無水乙醇萃取柚皮素，劇烈振蕩混勻后，13 500 r/min離心5 min取上清，有機相濾膜過濾后使用Agilent 1260高效液相色譜儀進行產物檢測，采用C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm) 進行色譜分離，色譜柱溫度控制在25 ℃，進樣量為10 μL，流動相為超純水 (0.3%乙酸) 和乙腈 (0.3%乙酸)，流速為1 mL/min。柚皮素通過乙腈/水的梯度洗脫進行分離：0–10 min，色譜條件為10%–40%的乙腈 (體積/體積)；10–15 min，色譜條件控制為40%–60%的乙腈；15–17 min，色譜條件控制在60%–10%的乙腈[14]。柚皮素的檢測波長為290 nm，以標準品柚皮素濃度為橫坐標，紫外區吸收峰峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 4CL過量表達對柚皮素產量的影響

以Y-01為出發菌株，將在不同強度啟動子 (P、P、P、P、P、P) 控制下的基因分別整合在基因組LEU2位點和rDNA區域。每株菌在發酵培養基中發酵得到柚皮素的產量，qPCR得到轉錄水平上的相對表達量，從而獲得柚皮素產量與轉錄水平的關系。

每株菌做3個平行，并重復3次，以確保實驗數據的可靠性，從而獲得36組數據。結果如圖1所示，柚皮素的產量與的相對表達量幾乎沒有相關性 (=?0.2，=1.62×10–3)，并且在基因組上單拷貝整合時有利于柚皮素的積累。以LEU2為整合位點，在啟動子P控制下，柚皮素的最高產量為165.9 mg/L (Y-02)，比Y-01 (46.1 mg/L) 提高了2.6倍；在啟動子P控制下，獲得最低產量81.1 mg/L (Y-03)，比Y-01增加了75.9%。以rDNA區域為整合位點過量表達，柚皮素產量在21.5 mg/L到97.0 mg/L之間變化，最低產量 (Y-12) 比Y-01減少了一半。結果表明過量表達并不一定能提高柚皮素的產量。

圖1 柚皮素產量與4cl轉錄水平的關系

2.2 CHS過量表達對柚皮素產量的影響

以上述相同的方法分析CHS過量表達對柚皮素產量的影響。結果如圖2所示，柚皮素的產量與轉錄水平有一定的線性正相關性 (=0.8，=6.24×10–10)，并且單拷貝數克隆時更有利于柚皮素的積累。以LEU2為整合位點時，在強啟動子 (P、P、P) 控制下過量表達，轉錄水平和柚皮素產量均較高，轉錄水平在0.8到1.0之間，柚皮素產量在185.3 mg/L到235.9 mg/L之間。當受P啟動子控制時，柚皮素最高產量為235.9 mg/L (Y-04)，較Y-01提高了4.1倍；當受P啟動子控制時，最低產量為114.0 mg/L (Y-05)，較Y-01的產量提高了1.5倍。以rDNA為整合位點過量表達，柚皮素產量在36.5–174.9 mg/L之間變化，最低產量 (Y-14) 比Y-01降低了20.8%。結果表明，在一定程度上過量表達更有利于柚皮素的大量積累。

圖2 柚皮素產量與chs轉錄水平的關系

2.3 CHI過量表達對柚皮素產量的影響

以上述相同的方法分析CHI過量表達對柚皮素產量的影響。結果如圖3所示，柚皮素的產量與轉錄水平的線性關系較小 (=0.4，=3.14×10–5)，并且CHI在基因組單拷貝克隆時更利于柚皮素的積累。

圖3 柚皮素產量與chi轉錄水平的關系

當LEU2作整合位點時，在啟動子P控制下，柚皮素最高產量達到168.5 mg/L (Y-06)，比Y-01提高了2.7倍；在啟動子P控制下，柚皮素最低產量為115.0 mg/L (Y-07)，比Y-01提高了1.5倍。以rDNA為整合位點過量表達，柚皮素的產量在81.9 mg/L到128.2 mg/L之間變化，最低產量 (Y-20) 比Y-01增加了77.7%。結果表明，過量表達提高了柚皮素的產量。

2.4 多拷貝克隆菌株傳代穩定性的驗證

結果如圖4所示，基因組整合重組菌Y-08、Y-09、Y-10、Y-11、Y-12及Y-13未傳代與傳代72代后拷貝數差異分別為9.0%、5.9%、23.6%、9.5%、10.1%、15.7% (圖4A)；基因組整合重組菌Y-14、Y-15、Y-16、Y-17、Y-18及Y-19未傳代與傳代72代后拷貝數差異分別為12.5%、1.3%、0.5%、5.8%、1.7%、2.2% (圖4B)；基因組整合重組菌Y-20、Y-21、Y-22、Y-23、Y-24及Y-25未傳代與傳代72代后拷貝數差異分別為6.4%、5.1%、7.9%、11.6%、5.7%、10.6% (圖4C)。上述結果表明，多拷貝克隆菌株傳代72代后拷貝數差異基本在15%以下，表明了在本實驗條件下多拷貝克隆菌株具有遺傳穩定性。

3 討論

文中以產柚皮素釀酒酵母Y-01為出發菌株，首次考察了關鍵酶4CL、CHS和CHI分別過量表達對柚皮素產量的影響。當在強啟動子P控制下并插入到LEU2位點時，達到最高產量235.9 mg/L，比目前報道的以釀酒酵母為宿主異源合成柚皮素最高產量113.0 mg/L[15]提高了1.1倍。在以前的研究中，因柚皮素合成需要3分子的丙二酰輔酶A，而胞內游離丙二酰輔酶A濃度由于脂肪酸生物合成的內在緊密調節維持在低水平，使丙二酰輔酶A一直被認為是黃酮合成的限制性前體因子。一般采用過量表達乙酰輔酶A羧化酶 (Acc1)[16]、敲除丙二酰輔酶A的競爭途徑[17]和基于反義RNA策略[18]及CRISPRi系統調控[19]等方法提高胞內丙二酰輔酶A含量，使細胞內丙二酰輔酶A最大程度地流向目標途徑以提高目標化合物產量。但是，最新報道顯示在釀酒酵母中異源合成柚皮素的前期階段，丙二酰輔酶A并不是柚皮素合成的限速前體，關鍵酶之間的協同表達更有利于柚皮素的積累[20]。對于調控途徑基因的協同表達，常用的方法是過量表達關鍵基因的同時調節其表達量，包括調節基因拷貝數、啟動子強度及降低蛋白質的降解等方式[15,21]。但這些方式所調控的范圍往往較大，目前還無法對蛋白表達進行精確調控。近年來，越來越多的計算機輔助方法應用于代謝通量平衡分析，如OptForce[22]、OptORF[23]和RobustKnock[24]等。許多基于計算機的途徑設計策略已成功應用于所需化合物的生產，例如三乙酸內酯[25]、琥珀酸[26]、脂肪酸[27]等。然而，由于代謝途徑涉及眾多的前體合成和相關修飾基因導致缺乏準確的酶反應參數，使這些調節策略的使用受到極大的限制。

目前，精確調控途徑基因之間的協同表達以平衡代謝通路還是一個巨大的難題。清楚地了解關鍵酶表達對產物柚皮素的影響有利于后期平衡代謝流的研究。據報道，CHS是燕麥葉中黃酮類化合物的限速酶[28]，植物可以通過調控表達來調節黃酮類化合物的產生[29-30]。而以微生物為生產宿主異源合成柚皮素途徑尚無明確的報道。文中提出了啟動子和拷貝數控制代謝工程，并采用qPCR方法檢測細胞中靶基因的轉錄水平，探究了關鍵酶4CL、CHS和CHI分別過量表達對柚皮素產量的影響。結果顯示在一定范圍內分別過量表達4CL、CHS和CHI均能提高柚皮素的產量，但是柚皮素產量與4CL或CHI的表達量沒有密切的聯系，而與CHS的表達量存在線性正相關 (=0.8，=6.24×10–10)，并且柚皮素的產量在過量表達CHS時達到最大值，這表明CHS表達對柚皮素產量的影響最大，并推測CHS是該研究中柚皮素合成途徑的限速酶。

此外，實驗結果顯示，基因單拷貝克隆的表達水平大多高于多拷貝克隆的表達水平，造成的原因可能與釀酒酵母rDNA區域的基因沉默有關[31]，外源基因插入該區域，其表達水平往往低于插入到常染色質區域的表達水平。rDNA作為外源基因整合位點，插入其內部的外源基因的遺傳穩定性還沒有明確的結論，這可能與外源基因的拷貝數和整合形式有關[32]。文中通過qPCR檢測未傳代和傳代后菌株中外源基因拷貝數并比較兩者的差異，發現在實驗條件下外源基因插入rDNA區域具有遺傳穩定性。文中確立了柚皮素產量與關鍵酶編碼基因相對表達量的關系，并揭示了CHS是黃酮化合物合成過程的關鍵調控位點，為后續深入研究代謝工程強化微生物合成柚皮素等重要黃酮類化合物提供了重要的參考依據。

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Quantitative effect of the expression level of key genes in naringenin synthesis on the accumulation level of target products

Tingting Jiao1,2, Jingwen Zhou1,2, and Sha Xu1,2

1 National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Naringenin is a natural flavonoid compound with anti-inflammatory, anti-oxidation, anti-viral, anti-atherosclerosis and other pharmacological activities. It is also an important precursor of other flavonoid synthesis and with great value of application. At present, the production of flavonoids such as naringenin by microbial methods has a low yield due to imbalance of metabolic pathways, which greatly limits its industrial application. In this study, a naringenin-producing strain ofY-01 was used in the research object. The expression levels of 4-coumaric acid: CoA ligase (4CL), chalcone synthase (CHS) and chalcone isomerase (CHI) were controlled by promoter and copy numbers to investigate the quantitative effect of key enzyme expression level on the accumulation level of target products. The results showed that the correlation between naringenin production and 4CL or CHI expression was not significant while there was a positive correlation with the expression level of CHS. Strain Y-04 with high yield of naringenin was obtained by regulating the expression level ofgene, and the yield was increased by 4.1-folds compared with the original strain Y-01. This study indicated that CHS is a key regulatory target of naringenin synthesis. Rational regulation of CHSexpression can significantly promote the accumulation of naringenin. The related results provide an important theoretical reference for the use of metabolic engineering to strengthen microbial synthesis of important flavonoids such as naringenin.

naringenin, expression level, key gene, promoter, copy number

December 19, 2018;

February 28, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 31670095).

Sha Xu. Tel/Fax: +86-510-85914371; E-mail: xus1984@jiangnan.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 31670095) 資助。

2019-03-19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190318.1121.002.html

焦亭亭, 周景文, 徐沙. 柚皮素合成關鍵基因表達水平對目標產物積累水平的量化影響. 生物工程學報, 2019, 35(7): 1256–1265.

Jiao TT, Zhou JW, Xu S. Quantitative effect of the expression level of key genes in naringenin synthesis on the accumulation level of target products. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1256–1265.

(本文責編 陳宏宇)