畢赤酵母液滴微流控高通量篩選方法的建立與應用

呂彤，涂然，袁會領，劉浩，王欽宏

畢赤酵母液滴微流控高通量篩選方法的建立與應用

呂彤1,2，涂然2，袁會領2，劉浩1，王欽宏2

1 天津科技大學 生物工程學院，天津 300457 2中國科學院天津工業生物技術研究所 中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308

巴斯德畢赤酵母是當前應用最為方便和廣泛的外源蛋白表達系統之一，為了進一步提高其表達外源蛋白的能力，文中建立了基于液滴微流控的畢赤酵母高通量篩選方法，并以木聚糖酶融合熒光蛋白為例，篩選獲得木聚糖酶表達和分泌能力提高的突變株。通過PCR擴增得到木聚糖酶基因和綠色熒光蛋白基因融合片段，并克隆到畢赤酵母表達載體pPIC9K中構建出木聚糖酶融合綠色熒光蛋白的質粒pPIC9K，電轉化至畢赤酵母GS115中得到表達木聚糖酶和綠色熒光蛋白的畢赤酵母SG菌株。該菌株經過常壓室溫等離子體誘變后進行單細胞液滴包埋，液滴培養24 h后進行微流控篩選，獲得高表達木聚糖酶的突變菌株，進而用于下一輪的誘變突變庫構建和篩選。以此類推，經過5輪液滴微流控篩選，獲得一株高產菌株SG-m5，其木聚糖酶活為149.17 U/mg，較出發菌株提升300%，分泌外源蛋白的能力較出發菌株提高160%。文中建立的畢赤酵母單細胞液滴微流控高通量篩選方法能達到每小時10萬菌株的篩選通量，篩選百萬級別的菌株庫僅需10 h，消耗熒光試劑體積100 μL，對比傳統的微孔板篩選方法降低試劑成本近百萬倍，為高效、低成本篩選獲得表達和分泌外源蛋白能力提高的畢赤酵母提供了一條新途徑。

畢赤酵母，液滴微流控，高通量篩選，單細胞，外源蛋白表達，蛋白分泌

巴斯德畢赤酵母表達系統是20世紀80年代開發的一種外源蛋白真核表達系統。該表達系統既具有原核表達系統操作簡單、成本低等特點，也具有真核表達系統的優質性，如糖基化、蛋白磷酸化等蛋白翻譯后的修飾功能，因此很快成為了應用最為廣泛的外源基因表達系統之一，已經成功地表達了包括激素、疫苗、細菌毒素、酶及其衍生物等超過1 000種外源蛋白[1]。雖然畢赤酵母表達系統是當前最有效、最方便的外源蛋白表達系統之一，但是仍存在外源基因不穩定、分泌效率差異、蛋白表達量低等問題[2]。為此，人們從外源基因、宿主菌、表達載體、翻譯后修飾和發酵條件等方面對畢赤酵母表達系統進行優化，并通過平板或孔板的篩選方法來獲得性能提高的表達菌株[3]。然而，這種常規的篩選方法存在成本高、耗時長、通量低等問題，無法快速有效地篩選出高表達菌株，因此建立一種有效的高通量篩選方法具有重要意義。

液滴微流控技術是近些年發展起來的高通量篩選新技術，該技術通過在幾個平方厘米的芯片上設計制備若干微通道，并在這些微通道內進行樣品制備、反應、分離、檢測及細胞培養、檢測和分選等操作步驟的一種技術平臺[4]。液滴微流控的篩選系統最大的優勢在于可以將單細胞包埋在液滴中，每個液滴皆可作為獨立的微反應器進行細胞的培養及其代謝物或酶生產，并通過對液滴內物質信號的檢測進行分析與分選。其最高篩選通量達108/d，具有檢測試劑消耗成本低、速度快、通量高的顯著特點，實現了包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等不同類型微生物宿主生產酶或代謝產物的高通量篩選[5-9]。在本研究中，我們以木聚糖酶為例，通過單細胞液滴包埋條件、液滴培養和篩選時間等參數優化，建立了基于液滴微流控的畢赤酵母表達系統的高通量篩選方法，為獲得表達和分泌外源蛋白能力提高的畢赤酵母工程菌株提供了一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

克隆宿主菌大腸桿菌DH5α，購自北京全式金公司；表達宿主菌畢赤酵母GS115為實驗室保藏菌種，木聚糖基因來源于芽孢桿菌sp. QH14/XynQH14，重組質粒pPIC9K-和含外源的畢赤酵母重組子SG由本實驗構建。

1.1.2 培養基

大腸桿菌生長液體培養基LB：酵母粉5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。

酵母生長液體培養基YPD：酵母粉5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L。

轉化及篩選固體培養基MD：YNB 13.4 g/L，生物素4×10–4g/L，葡萄糖10.0 g/L，瓊脂20.0 g/L。

誘導培養基BMGY：酵母粉5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，YNB 13.4 g/L，生物素4×10–4g/L，磷酸氫二鉀1.95 g/L，磷酸二氫鉀5.9 g/L，甘油10.0 g/L。

誘導培養基BMMY：酵母粉5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，YNB 13.4 g/L，生物素4×10–4g/L，磷酸氫二鉀1.95 g/L，磷酸二氫鉀5.9 g/L，甲醇2.5 mL。

1.1.3 主要試劑

DNA Marker購自北京博邁德生物技術有限公司。限制性內切酶(RⅠ、Ⅰ、Ⅱ)、T4 DNA連接酶均購自New England Biolabs (NEB) 公司。Fast、dNTPs購自北京全式金公司。DNA質粒提取試劑盒購自Axygen公司。瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒和快速純化試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。櫸木木聚糖(Beechwood xylan) 購自Sigma公司。其他試劑均為國產試劑。液滴微流控所用熒光底物、試劑和芯片購自杰靈科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建

用DNA質粒提取試劑盒提取pPIC9K質粒，經過RⅠ和Ⅰ過夜雙酶切后，用瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒回收載體片段。將800 bp的綠色熒光蛋白片段和600 bp的木聚糖酶通過PCR (PCR擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1.5 min，共35個循環；72 ℃ 5 min)融合得到1 400 bp的木聚糖酶融合綠色熒光蛋白片段，RⅠ和Ⅰ雙酶切后回收，用T4 DNA連接酶與酶切回收的載體pPIC9K連接，轉化至DH5α感受態細胞，涂布于LB平板，37 ℃培養，挑取單菌落進行陽性克隆驗證。采用通用引物5′-AOX1 (5′-GACTGGTTCCAATTGAC AAGC-3′) 和3′-AOX1 (5′-GCAAATGGCATTCTG ACATCC-3′) 進行測序驗證(北京華大基因)，測序正確的重組質粒命名為pPIC9K-。

1.2.2 畢赤酵母細胞的電擊轉化及誘導表達

重組表達質粒pPIC9K-經Ⅱ過夜酶切線性化后切膠回收，將10 μg線性化片段與80 μL畢赤酵母GS115感受態混合置于0.2 cm電轉杯，冰浴10 min，采用電穿孔法1.1 kV電壓電擊后加入500 μL山梨醇，30 ℃靜置2 h后涂布于MD平板至出現轉化子。

將重組畢赤酵母菌株接種于含有2 mL YPD培養基的試管中，30 ℃、250 r/min培養14 h，測定細胞濁度，當600為0.1時轉接至2 mL BMGY培養基中，30 ℃、250 r/min培養14 h，8 000 r/min離心2 min收集細胞，用無甲醇的BMMY培養基洗滌重懸后，當600為1時轉接至5 mL BMMY培養基(含終濃度1%的甲醇)，30 ℃、250 r/min誘導24 h后，熒光顯微鏡觀察GFP熒光蛋白表達信號。

1.2.3 液滴包埋方法

菌株接種于2 mL YPD培養基中，30 ℃、250 r/min培養14 h，當600為0.1時轉接至BMGY培養基，30 ℃、250 r/min培養14 h，菌體洗滌重懸當600為1時轉接至5 mL BMMY無甲醇培養基中，超聲處理(超聲破碎儀總功率950 W，使用功率4%，超聲9.9 s，停9.9 s，共 1 min) 獲得單分散的畢赤酵母細胞[10]。隨后采用液滴生成芯片制備單細胞液滴，其中水相為含有不同成分的細胞懸浮液，主要包含：20 μL不同菌體濃度(600為0.5或者0.3) 的單分散畢赤酵母細胞懸液，加入到培養基BMMY (含終濃度5% BSA和1%甲醇)，總體積200 μL。根據實驗需要，在上述水相中添加終濃度為10 μmol/L或者20 μmol/L的熒光檢測底物S13 (激發波長Ex 532 nm，發射波長Em 610 nm)。將油相和水相分別加入到1 mL注射器內，注射器置于注射泵中與芯片連接，設定油相300 μL/h，水相100 μL/h，通過液滴制備芯片制備單細胞液滴，生成液滴直徑約25 μm，單細胞液滴30 ℃靜置培養至所需時間后進行信號檢測。

1.2.4 常壓室溫等離子體誘變方法

將菌株接種于2 mL YPD試管中，30 ℃、250 r/min培養14 h，5 000 r/min離心5 min去除培養基，用生理鹽水重懸菌體，測定600值。當600為1時轉接至5 mL生理鹽水中超聲處理。將常壓室溫等離子體(Atmospheric and room temperature plasma) ARTP處理儀專用的載片在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻后取10 μL菌液均勻涂在載片上，用鑷子夾取載片置于等離子誘變儀的載片凹槽之中。參數設置為：載氣：高純氦氣(99.999%)；入射功率200 W；載體流速：10 SLM；處理溫度：25 ℃；反射功率：40 W；調節載臺下方旋鈕，使載片處于氣流端口2 mm處，照射時間分別為0、30、40、50、60、90 s進行誘變，誘變處理結束后，將載片置于裝有1 mL生理鹽水離心管中，用渦旋振蕩清洗2 min，將載片上的菌體全部洗脫，得到的菌懸液稀釋100倍，取100 μL涂布于YPD平板上，以0 s作為對照，30 ℃靜置培養至長出單菌落。觀察不同照射時間對致死率的影響。

致死率(%)=(B?A)/B×100% (1)

式中，A為ARTP誘變處理組平板上的菌落數；B為未經ARTP誘變處理的出發菌株平板上的菌落數。

從上述計算致死率的YPD平板上，按照不同的誘變處理時間條件挑選適量菌株(記錄為總菌株數)，培養后進行熒光信號檢測。以0 s平板上的單菌落作為對照菌株，熒光信號高于對照菌株的菌株統計為正突變株。

正突變率(%)=正突變菌株數/總菌株數×100% (2)

1.2.5 液滴微流控篩選

菌株經ARTP誘變后涂布于YPD平板上，14 h后洗脫菌體，當600為0.3時進行包埋，方法見1.2.3。液滴靜置于恒溫培養箱30 ℃培養24 h，篩選時設定液滴流速為10–15 μL/h，油相流速為200–250 μL/h，液滴篩選速度約250 Hz，分選閾值為液滴細胞信號最高的0.1%，收集約200–250個 液滴至1 mL YPD EP管中，分別涂布于多個YPD平板中，30 ℃培養待長出單菌落。

1.2.6 突變株搖瓶發酵

篩選后在YPD平板中隨機挑選一些單菌落接種于2 mL YPD培養基中，30 ℃、250 r/min培養14 h，當600為0.1時轉接至2 mL BMGY培養基，30 ℃、250 r/min培養14 h，洗脫重懸后當600為1時轉接至5 mL BMMY甲醇培養基誘導24 h。分別用酶標儀測定各菌株的600，全細胞和上清熒光值(激發波長Ex 490 nm，發射波長Em 520 nm)，DNS法測定酶活。

1.2.7 酶活檢測

通過DNS法檢測木聚糖酶活性[11]。取20 μL適當稀釋倍數的表達酶液，加入180 μL 1%木聚糖底物溶液，50 ℃保溫15 min后加入300 μL DNS顯色試劑終止反應，沸水浴8 min，加入1.5 mL 蒸餾水，在540 nm波長測定還原糖含量(以木糖計)，使用滅活的酶液作為對照。以木糖為底物繪制標準曲線，計算木聚糖酶酶活。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建

本研究中我們通過木聚糖酶融合綠色熒光蛋白的方式，將木聚糖酶的表達量和酶活性轉化為液滴微流控篩選所需的熒光信號，為后續根據熒光信號的強弱進行工程菌株分選奠定基礎。

將從sp. QH14/XynQH14 PCR擴增的木聚糖酶片段和綠色熒光蛋白通過PCR擴增融合得到1 400 bp的片段，并構建至畢赤酵母重組載體pPIC9K上。對轉化子提取質粒和RⅠ和Ⅰ雙酶切的驗證結果表明，瓊脂糖凝膠電泳分析顯示1 400 bp大小的目的片段和9 000 bp載體片段(圖1)。進一步測序結果表明酵母重組表達載體pPIC9K構建正確。

2.2 重組質粒的轉化與表達鑒定

畢赤酵母表達系統中外源目的基因需要整合到酵母染色體中進行穩定表達。實驗中，我們通過電轉化方法將重組質粒pPIC9K導入到畢赤酵母GS115中進行整合。通過提取基因組以pPIC9K載體通用引物5?AOX1和3?AOX1進行PCR擴增驗證整合效率。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明PCR擴增條帶1 400 bp與外源基因片段大小一致，表明畢赤酵母GS115/pPIC9K構建成功。

圖1 重組質粒的酶切鑒定

上述轉化子經含有1%甲醇的BMMY培養基誘導培養24 h后，置于熒光顯微鏡檢測。空宿主菌株GS115未見綠色熒光，轉化成功的轉化子可見細胞呈綠色熒光(圖2)，表明整合到染色體上的外源熒光蛋白基因成功表達。其中，熒光表達信號最強的重組轉化子SG作為后續實驗出發菌株。

2.3 液滴微流控篩選方法建立

2.3.1 單細胞液滴包埋條件優化

液滴微流控技術可以將單細胞包埋在液滴中，每個液滴皆可作為獨立的微反應器進行細胞的培養及其代謝物或酶生產，并根據液滴的物質信號進行檢測和分選。前期研究結果表明，畢赤酵母細胞存在多細胞粘連現象(圖2)，為獲得最佳的單細胞液滴包埋效果，本研究分別從粘連細胞的超聲分散處理和液滴包埋起始細胞濃度兩方面進行探究。

圖2 畢赤酵母與重組畢赤酵母轉化子熒光顯微鏡圖

超聲處理1 min后，畢赤酵母的粘連聚集情況顯著下降，95%以上為分散的單細胞。按照泊松分布計算，當起始細胞濃度600為0.3時，理論單細胞液滴包埋率是19.2%。實驗結果表明超聲處理顯著提高了單細胞包埋率，經過超聲處理后，實際得到的單細胞包埋率是13%，比未經超聲處理的單細胞包埋率高13倍。當增大起始細胞濃度(600為0.5) 時，實際得到的單細胞包埋率僅為8% (表1)。實時觀測顯示過高的起始細胞濃度易造成細胞在微流控芯片內堆積成團，使得實際分散細胞的數目減少，致使細胞液滴包埋率降低。綜上，最終確定最佳單細胞液滴包埋條件為菌體超聲分離處理1 min，細胞起始600為0.3。

2.3.2 液滴內木聚糖酶的熒光檢測

熒光底物是探測酶活性的靈敏手段，本研究通過木聚糖酶的酶促催化反應，將無熒光的底物Sxyn13生成有熒光的產物，并根據反應前后熒光強度變化評價工程菌的木聚糖酶活性。

在單細胞液滴制備過程中，加入20 μmol/L或者10 μmol/L濃度的熒光反應底物Sxyn13與細胞共同包埋在液滴。靜置培養細胞不同時間后，通過觀察不產木聚糖酶的空宿主對照菌(GS115) 和產木聚糖酶的工程菌(SG) 液滴內的熒光信號強度，檢測不同條件下的木聚糖酶表達量和酶活性。結果表明，隨著底物濃度增高，液滴熒光信號增強；隨著細胞液滴培養時間的增加，液滴內的熒光信號強度也同時增強，且未包埋細胞的空液滴也存在較強的背景熒光信號。在底物濃度為20 μmol/L時，工程菌SG的液滴熒光信號略強于對照菌株GS115的熒光信號，但兩者差顯不著異(圖3)。當底物濃度降低為10 μmol/L時，不同液滴間的熒光信號差異與高底物濃度時類似，未見明顯差異。綜上，采用熒光底物獲得熒光信號強弱差異用于篩選高酶活菌株的方式不適合本研究。

表1 不同條件下液滴的單細胞包埋率

Treatment: ultrasound treatment to disperse adherent cells; Theoretical rate (%): theoretical single cell droplets proportion; Actual rate (%): actual single cell droplets proportion.

2.3.3 液滴培養時間的優化

單細胞液滴隨著培養時間增加，液滴內的工程菌表達木聚糖酶和融合的熒光報告蛋白表達量增大。我們通過對不同培養時間(16 h、24 h和48 h)的單細胞液滴內融合熒光蛋白的熒光信號和木聚糖酶活性測定，探索了空宿主菌株和工程菌株的表達差異和最適液滴培養時間。隨著時間增加，工程菌株SG的熒光蛋白表達量增加，液滴的熒光信號對應增強(圖4A)。酶標儀測定木聚糖酶的結果顯示，SG工程菌株的木聚糖酶酶活隨著時間增加顯著增大，在24 h時SG工程菌株的木聚糖酶酶活比GS115空宿主對照菌株提高近4倍(圖4B)。結果顯示木聚糖酶酶活性的變化趨勢和液滴熒光信號一致，可以通過GFP熒光信號的強弱間接反映木聚糖酶酶活，用于液滴微流控篩選。繼續培養至48 h時檢測，兩種菌株的差異信號未見明顯增加，考慮縮短篩選周期的需求，因此單細胞液滴培養24 h后進行液滴微流控高通量分選。

圖3 對照菌和工程菌液滴的木聚糖酶酶活檢測熒光信號圖

圖4 液滴GFP熒光信號和木聚糖酶活檢測

通過上述研究，確定了液滴微流控的檢測篩選條件為：細胞經1 min間歇超聲處理分散成單細胞后，調整細胞起始濃度600為0.3制備單細胞液滴，液滴培養在含有1%甲醇的BMMY培養基，30 ℃誘導培養24 h后進行液滴微流控篩選。

2.4 ARTP誘變和突變體菌株庫構建

ARTP誘變通過控制等離子強度破壞其DNA結構，進而改變其生物特性，較高的致死率能獲得有效的突變率，研究表明致死率90%以上效果較佳[12]。分別選取0、30、40、50、60、90 s共計6個不同的ARTP處理時間，對出發菌株SG進行誘變處理并統計菌落數，繪制致死率曲線(圖5)。結果顯示30 s內致死率急速增長到60%，從40 s到90 s緩慢增大致死率接近100%。根據現代育種理論，當致死率在90%–95%之間時，突變庫中突變體正向突變概率最大[13]，結合致死曲線圖可知當誘變時間為60 s時，突變庫致死率為95%處于最佳誘變致死區間，且該時間點的正突變率為20%，高于其他時間點的正突變率，因此本實驗選擇60 s為最佳誘變時間。

2.5 突變菌株庫的液滴微流控篩選

以SG為出發菌株，經ARTP誘變后建立突變菌株庫，進行單細胞液滴制備、培養和篩選，得到蛋白熒光信號強的液滴涂布平板。從篩選獲得的單菌落中隨機挑選出部分菌株，采用搖瓶發酵，甲醇誘導24 h后測定發酵液上清的熒光值及酶活，得到一株木聚糖酶高表達的菌株SG-m1。以SG-m1為出發菌株，進行同樣流程的第二輪誘變建庫和液滴微流控篩選，以此類推。經過5輪篩選，突變菌株表達木聚糖酶的酶活力逐步增加，最終得到一株木聚糖酶高表達菌株SG-m5，發酵液上清的酶活力值為149.17 U/mg，比出發菌株SG提高300% (圖6)。

圖5 ARTP誘變致死曲線

圖6 菌株發酵上清液的木聚糖酶酶活

2.6 菌株分泌特性研究

通過測定菌體的發酵液的上清和細胞菌體的熒光值，計算上清/細胞菌體的熒光比例來探究菌株的分泌特性。

將5輪依次篩選出的高表達菌株分別進行50 mL搖瓶發酵，甲醇誘導24 h后測定其600值，上清熒光值、細胞菌體熒光值，并計算出分泌比例。對菌體的細胞生長曲線和鏡檢結果表明，菌體處于對數生長期，菌體完整未裂解，且菌體沉淀的熒光信號高于菌體上清液的熒光信號。經過多輪的液滴微流控篩選，獲得的高產菌株不僅木聚糖酶的產量得到提高，而且分泌能力也得到了提高，對比出發菌株SG，篩選獲得突變菌株SG-m5的分泌能力提高了160% (圖7)。

圖7 菌株分泌特性分析

3 討論

畢赤酵母作為一種成熟的外源蛋白表達系統，已經實現了1 000多種外源蛋白的表達，其多個優良的表達特性早已得到廣泛驗證，如分泌效率高、遺傳操作簡單、培養成本低等。目前，針對外源蛋白在畢赤酵母中的高效表達，一方面在分子水平上對外源基因進行改造，能夠大大提高外源基因的表達，另一方面利用高通量篩選技術來獲得高表達菌株[3]。先前報道中，畢赤酵母的篩選方法主要是基于平板等傳統方法，如利用剛果紅染色法或者G418抗性篩選，其篩選的庫容量為2 000個左右[14-15]。由于畢赤酵母的外分泌特性，表達的產物分泌到細胞外，不能使用針對細胞篩選的流式細胞儀[16]。液滴微流控作為新興的高通量篩選方法，能將單細胞包埋在獨立的微反應器中，進行細胞的培養及其代謝物或酶表達，并通過對液滴內物質信號的檢測進行分析與分 選[6-10]。本研究以木聚糖酶融合熒光蛋白的畢赤酵母菌株為例，通過對單細胞液滴制備、液滴內熒光信號檢測、篩選模型測試等條件探索，建立了畢赤酵母液滴微流控的篩選方法，其單細胞包埋效果及分選速度和效果等與已報道的釀酒酵母液滴微流控篩選體系具有可比性。本研究建立的畢赤酵母液滴微流控篩選方法的篩選通量可以達到每小時10萬個菌株，篩選百萬容量的菌株庫僅需10 h，消耗熒光試劑體積100 μL，對比傳統的微孔板篩選方法降低試劑成本近百萬倍，填補了畢赤酵母高通量篩選技術的空缺，為高效、低成本篩選獲得表達和分泌外源蛋白能力提高的畢赤酵母菌株提供了一條新途徑。

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Development and application of a droplet-based microfluidic high-throughput screening of Pichia pastoris

Tong Lü1,2, Ran Tu2, Huiling Yuan2, Hao Liu1, and Qinhong Wang2

1 College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China 2 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

is one of the most convenient and widely used heterologous protein expression systems. To further improve its ability to express heterologous proteins, we developed a high-throughputscreening method based on droplet microfluidic and demonstrated the method by screening and obtaining mutants with enhanced xylanase expression and secretion abilities. We used PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification to obtain a fusion fragment of xylanasegene and green fluorescent proteingene, and cloned this fragment into pPIC9K, the expression vector of, to construct the plasmid pPIC9K-that recombined the DNA fragments of xylanase and green fluorescent protein. After this plasmid enteredGS115 by electroporation, theSG strain that could express xylanase and green fluorescent protein was obtained. The above-said strains were then mutagenized by atmospheric room temperature plasma and subsequently encapsulated to form single-cell droplets. After 24-hour cultivation of the droplets, microfluidic screening was carried out to obtain the mutant strain with high xylanase expression for further construction and screening of the next mutagenesis library. After five rounds of droplet microfluidic screening, a highly productive strainSG-m5 was obtained. The activity of the expressed xylanase was 149.17 U/mg, 300% higher than that of those expressed by the original strain SG. This strain’s ability to secrete heterologous protein was 160% higher than that of the original strain. With a screening throughput of 100 000 strains per hour, the high-throughputscreening system based on single-cell droplet microfluidic developed by the present study screens a library with million strains in only 10 hours and consumes only 100 μL of fluorescent reagent, thus reducing the reagent cost by millions of times compared with the traditional microplate screening and more importantly, providing a novel method to obtainwith high abilities to express and secret heterologous proteins by efficient and low-cost screening.

, droplet microfluidics, high-throughput screening, single cell, heterologous protein expression, protein secretion

February 1, 2019;

April 15, 2019

Science and Technology Service Network Initiative of the Chinese Academy of Sciences (No. KFJ-SW-STS-165)，Instrument Developing Project of the Chinese Academy of Sciences (No. YJKYYQ20170023).

s: Ran Tu. Tel/Fax: +86-22-24828705; E-mail: tu_r@tib.cas.cn Qinhong Wang. Tel/Fax: +86-22-84861950; E-mail: wang_qh@tib.cas.cn

中國科學院科技服務網絡計劃(No. KFJ-SW-STS-165)，中國科學院科研裝備研制項目(No. YJKYYQ20170023) 資助。

2019-04-24

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190424.1038.001.html

呂彤, 涂然, 袁會領, 等. 畢赤酵母液滴微流控高通量篩選方法的建立與應用. 生物工程學報, 2019, 35(7): 1317–1325.

Lü T, Tu R, Yuan HL, et al. Development and application of a droplet-based microfluidic high-throughput screening of. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1317–1325.

(本文責編 郝麗芳)