啤酒酵母細胞壁環境壓力應答機制研究進展

張明芳，王金晶，鈕成拓，李永仙，鄭飛云，劉春鳳，李崎

啤酒酵母細胞壁環境壓力應答機制研究進展

張明芳1,2，王金晶1,2，鈕成拓1,2，李永仙1,2，鄭飛云1,2，劉春鳳1,2，李崎1,2

1 江南大學 生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學 釀酒科學與工程研究室，江蘇 無錫 214122

酵母細胞壁在細胞形態學的建立和維持中起重要作用，有助于細胞抵御環境變化。細胞壁主要由β-葡聚糖、甘露糖蛋白和幾丁質組成，其組成和結構會由于壓力脅迫發生動態重構。同時為了適應環境壓力變化，啤酒酵母細胞壁在長期馴化過程中表現出相關壓力應答機制。文中介紹了啤酒酵母細胞壁組成與結構，并綜述了細胞壁重構與信號通路調控的分子機制。

啤酒酵母，細胞壁，壓力應答，細胞壁重構，信號通路

細胞壁作為酵母細胞最外層結構具有保護細胞、維持細胞形態、為細胞表面蛋白提供吸附支架等功能，且能夠通過信號通路感應環境的變化進行調控來維持細胞壁完整性[1]。啤酒酵母受到各種環境壓力的脅迫時易發生自溶[2]，細胞壁結構逐漸疏松，同時細胞壁組分發生緩慢降解[3]。因此，細胞壁對環境壓力的應答在維持細胞形態中發揮重要作用[4-5]。

酵母細胞壁對環境壓力應答的途徑主要有細胞壁重構和信號通路調控。細胞壁重構包括組成重構和交聯重構，受到環境壓力脅迫時，細胞壁的組分含量增加，與交聯相關基因表達量發生變化，同時相關交聯結構增強[6-7]。細胞對不同壓力的應答涉及多種信號通路和信號因子，信號通路調控壓力信號的轉導，從而使相關基因的表達量發生變化[8]。文中介紹了啤酒酵母的細胞壁組成、結構與交聯，綜述了酵母細胞壁在壓力脅迫下的細胞壁重構動態變化及其信號通路調控機制，為提高啤酒酵母壓力耐受性和研究壓力應答機制提供理論依據與參考。

1 酵母細胞壁組成與結構

1.1 細胞壁組成

酵母細胞壁約占細胞干重的15%?30%，主要由甘露糖蛋白、β-葡聚糖和少量的幾丁質組成[9]。通過電子顯微鏡觀察得到細胞壁分為兩層，外層富含甘露糖蛋白，內層主要物質為葡聚糖與少量幾丁質。葡聚糖分為β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖。β-1,3-葡聚糖一般通過β-1,3鍵由1 500個葡萄糖殘基構成線性分子，作為細胞壁的骨架與其他組分相交聯，是最為重要的組分。幾丁質只占細胞干重的1%–2%[10]，是由氨基葡萄糖殘基通過β-1,4鍵合成的鏈狀結構，通常位于母細胞與新生芽體之間和新分離子細胞的側壁中。幾丁質使細胞具有一定剛性并在細胞分裂中起重要作用，雖然在細胞壁組分中含量微少，但卻是細胞生長所必不可少的。甘露糖蛋白占細胞壁干重的30%–50%，由甘露聚糖和經過糖基化修飾的蛋白組成，分為磷脂酰肌醇蛋白 (Glycosylphosphatidylinositol cell wall proteins，GPI-CWPs) 和內重復蛋白 (Proteins with internal repeats，Pir-CWPs)[11]。

1.2 細胞壁結構與交聯

酵母細胞壁是具有高度彈性、連續的三維網絡，β-1,3-葡聚糖是網絡的骨架，其他組分作為側鏈相互交聯延伸構成復雜的細胞壁網絡系統 (圖1)。以β-1,3-葡聚糖為主體，細胞壁多糖之間有3種交聯方式[9]。首先是幾丁質還原端通過β-1,4鍵與β-1,3-葡聚糖連接，此為最主要的多糖交聯方式 (圖1B)。β-1,3-葡聚糖為具有柔性的螺旋狀分子結構，賦予細胞壁一定的彈性，而幾丁質的剛性會影響β-葡聚糖的溶解度。第2種方式是幾丁質還原端通過β-1,3-葡萄糖與β-1,6-葡聚糖連接 (圖1A)。第3種連接是β-1,3-葡聚糖通過β-1,6-葡萄糖相互連接，使細胞壁葡聚糖形成緊密網絡 (圖1C)。多糖之間的交聯構成細胞壁內層，甘露糖蛋白的交聯則構成細胞壁外層。GPI-CWPs通過糖苷鍵與β-1,6-葡聚糖連接，是最多的細胞壁蛋白與多糖的交聯方式 (圖1D)。Pir-CWPs是通過蛋白質重復序列中谷氨酸的羧基以酯鍵與β-1,3-葡聚糖中的羥基相連，對堿敏感 (圖1E)。而蛋白之間是由二硫鍵連接，可通過SDS解鏈 (圖1F)[11]。

圖1 細胞壁結構與交聯[9]

2 細胞壁重構與環境壓力應答

細胞壁中各組分相互交聯，賦予其既堅硬又具有彈性的特性，具有維持細胞形態、保護細胞等功能。細胞壁具有高度動態性，酵母細胞壁的組成和結構會由于環境壓力發生動態變化，通過細胞壁重構對環境壓力進行應答[12]。細胞壁重構 (Cell wall remodeling) 是指破壞細胞壁組分之間的交聯，以及將新合成的多糖經糖基化酶進行伸長、分枝和交聯到原有的細胞壁中[13]。細胞壁組成和交聯、細胞壁剛性和彈性在環境壓力應答過程中發生相應變化[14]。

2.1 細胞壁組成重構

細胞壁重構一般會造成細胞壁多糖組成變化，組分含量的增加能夠提高細胞壁的剛性。 β-葡聚糖鏈是細胞壁的骨架，因此β-葡聚糖含量的提高有助于維持細胞壁完整性和抵御發酵過程中的環境壓力[15]。甘露糖蛋白位于細胞壁最外層直接與外界環境接觸，在高滲透壓環境下，甘露糖蛋白含量增加使得外層結構更為緊密以適應環境壓力[16]。為了提高菌株抗壓能力，可通過改造酵母獲得細胞壁剛性菌株。本研究組通過復合壓力平板對傳統紫外線誘變處理過的啤酒酵母菌株進行篩選，得到兩株抗壓能力明顯提高的菌株。對細胞壁的多糖組分進行分析發現葡聚糖與甘露聚糖含量均明顯增加，使得細胞壁能更好地抵擋外界環境因素的干擾[17]。

由于酵母細胞壁復雜的交聯結構，研究兩種或多種組分之間的動態變化關系有助于進一步解析細胞壁重構對環境壓力的應答機制。改變啤酒酵母的生長pH與培養基中甘油濃度，甘露聚糖蛋白和β-1,6-葡聚糖的含量均有增加，且<0.05具有顯著性，相關系數=0.661[18]。Sestak等敲除酵母中編碼細胞壁蛋白的和基因，發現葡聚糖與甘露聚糖的含量沒有顯著變化；依次利用β-1,3-葡聚糖酶和β-1,6-葡聚糖酶水解細胞壁測定游離葡萄糖與甘露糖，發現甘露聚糖與β-1,6-葡聚糖的交聯發生變化，與野生菌相比甘露聚糖與幾丁質的交聯程度增加。說明基因敲除所導致的細胞壁重構不僅表現在組分含量的變化，還表現在細胞壁組分之間的交聯變化[19]。

2.2 細胞壁交聯重構

2.2.1 甘露糖蛋白-葡聚糖交聯重構

對酵母自溶全過程進行跟蹤發現，由于葡聚糖酶水解葡聚糖導致細胞壁內層失去其纖維狀連續結構，隨后細胞壁內外層交聯紊亂，細胞壁逐漸降解[20]。因此細胞壁蛋白與多糖之間的正常交聯是保證細胞進行生理活動的基礎之一，其中GPI-CWP→β-1,6-葡聚糖→β-1,3-葡聚糖是正常狀態下最主要的交聯方式。

在該結構中，甘露糖蛋白提供細胞壁表面的負電荷和親水基團，與酵母細胞的絮凝性有關。啤酒酵母的絮凝有助于酵母本身抵抗發酵期間的酒精脅迫和保持細胞活性，且甘露糖蛋白具有高度交聯的剛性結構，這些特性共同增強酵母對滲透壓和分解酶的抗性。在啤酒發酵過程中，隨著CO2的產生啤酒酵母處于厭氧環境，與酵母絮凝性有關的甘露糖蛋白基因和基因的表達量發生變化，調控細胞壁交聯以應答環境壓力[21]。作為對多重壓力的應答機制之一，甘露糖蛋白和葡聚糖會發生交聯重構。據報道啤酒酵母在經過3–7次發酵周期后甘露糖蛋白表現出更緊密的交聯結構并且含量增加；(α1→4)-糖苷鍵和 (β1→4) 糖苷鍵的交聯結構的增加超過 (1→3) 糖苷鍵，這種類纖維素的結構對細胞剛性的增強十分重要[22]。

甘露糖蛋白-葡聚糖交聯主要由葡聚糖重構酶負責，包括Gas1p、Exg1p和Bgl2p，其在細胞壁合成與壓力應答的過程中活躍著。Gas1p為GPI錨定蛋白，負責β-1,3-葡聚糖的延長并且涉及酵母對低pH、高滲透壓力的適應機制；Exg1p和Bgl2p分別具有外、內切-β-1,3-葡聚糖酶活性，參與β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖的重構。目前對于葡聚糖重構酶參與環境壓力應答機制的研究多在釀酒酵母中，發現過量表達能夠增強酵母對低pH和高滲透壓的抗性[23]，敲除基因引起幾丁質含量上升[24]，敲除與過表達基因分別導致β-1,6-葡聚糖含量上升和下降[25]。這些研究結果對啤酒酵母細胞壁環境壓力應答機制的研究具有借鑒意義。

2.2.2 葡聚糖-幾丁質交聯重構

增強葡聚糖-幾丁質的交聯結構是細胞對環境壓力的應答之一，其中GPI-CWP→β-1,6-葡聚糖←幾丁質這一交聯起到重要作用。葡聚糖與幾丁質的交聯由Crh1p和Crh2p進行催化合成。Crh1p和Crh2p為轉糖基酶，主要負責幾丁質與β-1,3-葡聚糖、β-1,6-葡聚糖之間的交聯[26]。酵母細胞壁對環境壓力的應答使得的表達受到調控，葡聚糖-幾丁質交聯結構隨之進行重構，有利于增強細胞壁的剛性。葡聚糖-幾丁質交聯程度的測定可用C14同位素標記法特異性標記幾丁質，用不同的水解酶，如β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶和幾丁質酶處理細胞壁，然后羧甲基化后通過排阻色譜比較各餾分[27]。酵母中大約40%的幾丁質是游離的，而與β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖交聯的幾丁質含量分別占總含量的40%–45%和15%–20%。

雖然細胞壁中幾丁質含量微少，但是β-葡聚糖與幾丁質交聯組成的細胞壁骨架在細胞壁生物合成和完整性中起關鍵作用，也是決定細胞壁物理性質的重要因素。細胞壁組分的交聯結構賦予細胞壁一定的剛性，這種剛性使得細胞壁在面對環境壓力急劇變化時能夠有效控制細胞體積變化，有利于壓力的緩沖[14]。同時β-葡聚糖的合成影響葡聚糖-幾丁質交聯結構，從而導致酵母細胞壁完整性發生變化。Wang等通過敲除酵母細胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶、基因，發現菌株表現出對滲透壓和細胞壁抑制劑的高度敏感，β-1,3-葡聚糖的合成在細胞應答環境壓力過程中不可或缺[28]。

3 信號通路調控與環境壓力應答

環境壓力應答過程中酵母細胞壁的多糖含量平衡、交聯類型調整、重構酶調節等變化是由于細胞壁有關基因表達改變而引起的。環境壓力激活細胞相應信號轉導通路，從而調節通路相關基因表達和代謝[29]。

3.1 CWI信號通路

有不少信號通路參與其中，其中酵母細胞壁完整性 (Cell wall integrity，CWI) 信號通路起到主要調控作用。CWI信號通路由MAPK級聯系統介導，首先由細胞壁壓力感應因子Wsc1-3p、Mid2p和Mtl1p作用于鳥嘌呤核苷酸交換因子 (GEFs) Rom2p，激活Rho1p。Rho1p是CWI信號通路的主要調節因子，不僅負責細胞外界信號的輸入還涉及細胞壁合成、蛋白分泌信號的輸出。隨后蛋白激酶C (Protein kinase C，Pkc1) 被激活[30]，Pkc1p作為MAPK級聯系統的核心，激活MAPK模塊使Bck1p磷酸化，再由Bck1p將信號傳導至Mkk1p/Mkk2p，最終激活Slt2p。Slt2p作用于環境壓力應答的Rlm1p和調控細胞周期的Swi4/6p兩個轉錄因子。Rlm1p調節至少25個基因的表達，大多數與細胞壁蛋白或細胞壁應激蛋白的編碼有關[31]。作為酵母細胞壁環境壓力應答最重要的途徑之一，CWI信號通路上的基因表達調控對酵母細胞適應壓力環境顯得尤為重要。負責β-1,3-葡聚糖合成的家族基因包括、和。Fks1p和Fks2p分別為催化亞基(Catalytic subunit) 和調節亞基 (Regulatory subunit)。Fks3p是Fks1p的同源蛋白，與Fks1p和Fks2p有56%的同源性，通過調節葡聚糖合成影響子囊孢子壁的形成。家族基因的缺失會激活CWI信號通路，導致細胞壁重構。本研究組敲除了酵母的基因，CWI信號通路上游的感應因子基因表達量發生明顯上調，細胞壁葡聚糖含量增加，重組菌的抗自溶能力增強[32]?；虻纳险{有利于細胞壁快速應答環境變化，增強對環境的適應能力。此外，與基因同為感應因子的和基因在酵母自溶過程中轉錄水平發生下調。啤酒酵母自溶過程中細胞壁受到外界壓力脅迫，細胞壁對低滲、氧化等壓力的感知降低，和基因的轉錄水平下調導致細胞壁對于這些壓力的抵御能力下降[33]。

3.2 CWI與HOG信號通路的共同調控

盡管CWI信號通路是細胞壁的主要調控路徑，但是維持細胞穩定必然需要與其他信號通路共同調控。HOG (High-osmolarity glycerol) 信號通路和CWI信號通路同屬于級聯調控，主要調控細胞對高滲透壓的應答。HOG信號通路包含Sho1p和Sln1p兩條分支：Sho1p支路由Sho1p、Hkr1p和Msb2p感應因子傳遞信號，激活PAK家族的Ste20p，隨后級聯調控啟動，Ste11p、Pbs2p、Hog1p依次被激活；Sln1p支路的壓力信號通過應答調節蛋白Ypd1p和Ssk1p傳遞至Ssk2p/Ssk22p級聯調控，磷酸化激活Pbs2p和Hog1p。被激活的Hog1p作用于多個轉錄因子，從而調控細胞應答環境壓力[34]。在啤酒酵母自溶過程中，感應因子、和MAPK模塊中的、、基因表達發生明顯上調，說明環境壓力激活了細胞的抗滲透壓能力[35]。啤酒酵母在高滲透壓環境下連續發酵20代，發現基因表達明顯上調，細胞調節HOG信號通路上基因表達以適應環境的滲透壓力[36]。

當酵母受到溫度壓力時，CWI信號通路起主要調控作用。感應因子Wsc1p和Mid2p傳遞壓力信號激活通路，調控細胞應激基因表達，導致細胞膜流動性增加，胞內海藻糖積累[37]。同時觀察到Sho1p和Hog1p發生高度磷酸化，說明HOG信號通路的Sho1p分支共同參與熱壓力的應答調控[38]。當酵母受到高滲透壓脅迫時，細胞膨壓減小、體積縮小。胞內甘油的溶出和細胞膨壓的變化激活HOG信號通路，引起胞內甘油積累。隨后胞內甘油水平的變化導致CWI信號通路的Slt2p級聯調控模塊被激活，有助于細胞維持細胞壁形態以抵御外界滲透壓脅迫[39]。對于氧化壓力應答來說，Sln1p和Sho1p通路基因缺失的酵母表現出對過氧化氫的高度敏感，且Hog1p發生高度磷酸化，說明CWI和HOG信號通路共同作用于細胞的氧化壓力應答[40]。酵母細胞在Zymolyase壓力脅迫下，HOG和CWI信號通路之間的共同調控現象更為明顯。Zymolyase是一種β-1,3-葡聚糖酶，能夠抑制細胞壁合成。細胞壁損傷壓力由Sho1p途徑傳導至Hog1p，隨后激活CWI信號通路上的Rho1p引發下游的調控，補償細胞壁損傷。這種調控過程不涉及CWI信號通路的上游感應因子與鳥嘌呤核苷酸交換因子，CWI通路的激活依賴于HOG通路的信號傳導[41](圖2)。

圖2 細胞壁完整性(CWI)信號通路與高滲透性甘油(HOG)信號通路[42]

因此，酵母受到上述壓力脅迫時HOG和CWI信號通路的應答有所不同，Hog1p的磷酸化快速且短暫，而Slt2p在其后才被激活且可維持一段時間。HOG信號通路對環境壓力作出快速應答，CWI信號通路在HOG通路被激活的情況下參與維持細胞壁的穩定性，二者的共同調控機制用于維持細胞的正常生理活動，高效精確地應答多種環境壓力。這種與CWI途徑復雜的共同調控現象的機制研究在釀酒酵母中已有了一定的進展，然而在啤酒酵母中仍需進一步研究。

4 展望

啤酒酵母是決定啤酒質量的重要因素之一，優良的酵母需要具有高發酵能力、抗環境壓力與抗自溶能力等條件，使其對環境壓力的變化具備快速適應能力和耐受性。目前啤酒酵母細胞壁壓力應答的研究多在于發酵或自溶過程中細胞壁多糖組分變化和細胞壁壓力應答基因研究，但對于細胞壁重構的酶及組分交聯的詳細機制仍需要進一步了解?；诩毎诮M分交聯對酵母剛性的貢獻，可增強和改造組分交聯結構提高酵母耐壓能力。酵母在壓力應答過程中涉及基因表達水平和胞內代謝物的變化，通過轉錄組學、蛋白組學以及代謝組學的分析可對酵母環境壓力應答機制有更全面的了解。通過了解啤酒酵母細胞壁的動態變化及其環境壓力應答機制，有利于提高啤酒質量，指導傳統方式育種選育環境耐受性和抗自溶性能優良的工業啤酒酵母，促進啤酒行業發展。

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Progress in brewer’s yeast cell wall stress response

Mingfang Zhang1,2, Jinjing Wang1,2, Chengtuo Niu1,2, Yongxian Li1,2, Feiyun Zheng1,2, Chunfeng Liu1,2, and Qi Li1,2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China2 Laboratory of Brewing Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Yeast cell wall plays an important role in the establishment and maintenance of cell morphology upon the cell wall stress. The cell wall of yeast consists of β-glucans, mannoproteins and chitin. The composition and structure remodel due to cell wall stress. Brewer’s yeast cell wall exhibits stress response during long-term acclimation in order to adapt to environmental changes. This paper reviews the composition and structure of yeast cell wall and the molecular mechanisms of cell wall remodeling and signal pathway regulation.

brewer’s yeast, cell wall, stress response, cell wall remodeling, signal pathway

December 11, 2018;

February 18, 2019

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31571942, 31601558, 31771963), Collaborative Innovation Center of Jiangsu Modern Industrial Fermentation in Jiangnan University.

Qi Li. Tel: +86-510-86918176; Fax: +86-510-85805219; E-mail: liqi@jiangnan.edu.cn

國家自然科學基金 (Nos. 31571942, 31601558, 31771963)，江蘇省現代工業發酵協同創新中心資助。

2019-04-17

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190416.1508.001.html

張明芳，王金晶，鈕成拓, 等. 啤酒酵母細胞壁環境壓力應答機制研究進展. 生物工程學報, 2019, 35(7): 1214–1221.

Zhang MF, Wang JJ, Niu CT,et al. Progress in brewer’s yeast cell wall stress response. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1214–1221.

(本文責編 陳宏宇)