滾環擴增信號放大技術在生物檢測中應用的研究進展

占忠旭，劉巨，陳博璐，湯奕舟，陳官華，許恒毅

滾環擴增信號放大技術在生物檢測中應用的研究進展

占忠旭，劉巨，陳博璐，湯奕舟，陳官華，許恒毅

南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047

滾環擴增 (Rolling circle amplification，RCA) 是一種快速、靈敏且恒溫的單鏈DNA (Single-stranded DNA，ssDNA) 擴增技術，與染色或探針聯用可實現檢測信號的放大，在生物檢測等方面得到廣泛的應用。文中對RCA的構建方法進行了簡介，綜述了近幾年其在致病菌、核酸腫瘤標記物、蛋白質、生物小分子和病毒等檢測中的研究進展，并對其未來的發展趨勢進行了展望。

滾環擴增，恒溫，生物檢測

滾環擴增 (Rolling circle amplification，RCA) 是建立于20世紀90年代中期的DNA擴增技術，該技術是借鑒自然界中環狀病原生物體DNA分子滾環式復制方式發展的一種恒溫擴增技術，在研究初期就得到科研人員的高度關注[1-2]。RCA反應發生的關鍵在于構建一個完整的單鏈DNA環用于后續擴增，RCA成環方式包括粘性末端成環和平末端成環。RCA主要有線性RCA (Linear RCA，LRCA)、超分支RCA (Hyper branched RCA，HRCA) 和多引物RCA (Multiple primer RCA) 等[3]。文中總結了常見的RCA構建方法，綜述了其在致病菌、核酸腫瘤標記物、蛋白質、生物小分子和病毒檢測中的應用，并對其未來的發展趨勢進行了展望。

1 RCA構建成環分類

1.1 鎖式DNA成環

鎖式DNA成環方式指運用一條線狀的DNA為引物將鎖式DNA的5′端和3′端拉近，從而形成帶有缺口的環狀DNA (圖1A)。在T4 DNA連接酶的作用下將帶缺口DNA連接成完整的環狀模板，加入核酸外切酶將引物裂解從而生成一個完整的環狀模板用于后期擴增[4-5]。

1.2 啞鈴DNA成環

相比鎖式DNA成環，啞鈴狀DNA成環方式不需要額外添加引物，如圖1B所示，通過對DNA進行設計使其自身雜交成啞鈴狀模板，從而將5′端和3′端拉近，進而用T4 DNA連接酶直接連接成環狀模板。啞鈴狀DNA環雖然設計相對復雜，但避免了用外切酶將DNA裂解的步驟[6-7]。

1.3 平末端成環

前兩者都是將DNA的5′端和3′端拉近，形成粘性末端成環。平末端成環方式異于粘性末端成環，如圖1C所示，將DNA設計成含有平末端的發卡結構，發卡結構的5′與另外一個發卡的3′在T4 DNA連接酶的作用下連接成完整的啞鈴狀的環狀DNA[8]。平末端成環方式相對啞鈴DNA成環方式在DNA設計上更簡單，但其成環效率不如粘性末端成環方式高。

2 滾環擴增信號放大技術的分類

2.1 線性RCA

線性RCA也被稱為單引物RCA，如圖2A所示，單鏈引物與環狀模板進行結合，在DNA聚合酶的作用下，引發鏈沿著環狀模板從5′–3′方向進行延伸，催化dNTPs合成單鏈DNA分子。當完成一圈復制后，在DNA聚合酶的催化以及核酸鏈間位移活動的作用下，新合成的核酸鏈取代之前的舊鏈進一步循環延伸。因此，可在短時間內快速產生大量的與環狀模板鏈完全互補的DNA[9]。

2.2 超分支RCA

超分支RCA也被稱為指數RCA或雙引物RCA，其原理和線性RCA相似，只是在擴增體系中加入第二條新的引物 (與環狀模板序列完全一致)。如圖2B所示，當發生線性RCA時第二條引物與其擴增產物結合并酶促延伸，置換掉下游雜交到擴增產物上的引物延伸鏈，之后置換掉的延伸產物又可以作為第一條引物的模板進行擴增，經過不斷的延伸和置換，在短時間內擴增產物呈指數遞增，最終擴增出不同長度的雙鏈DNA，其擴增效率大于109[10]。

圖1 RCA構建成環分類

圖2 RCA的分類

2.3 多引物RCA

多引物RCA，即在RCA反應體系中引入多條引物參與擴增。如圖2C所示，在原理上其與線性RCA一樣，多條引物與環狀模板結合后在聚合酶的作用下進行延伸，上游引物延伸到下游引物的結合點并置換下游引物，可在短時間內得到大量的DNA[11]。

3 滾環擴增技術的應用

RCA具有高擴增效率并且能在恒溫條件下進行擴增，研究者們基于此建立了一系列生物檢測方法，表1概括了近年來RCA技術在生物檢測中的應用。

3.1 致病菌的檢測

表1 RCA信號放大技術在生物檢測物中的應用

致病菌是能引起疾病的微生物，也被稱為病原微生物。Hao等[12]設計了金黃色葡萄球菌與RCA引物競爭適配子序列從而釋放出RCA引物的反應，進而引發RCA，產生ssDNA用于捕獲游離的cDNA-ABEI-AuNFs復合物，從而較少量的復合物吸附于WS2納米材料，保持原有化學發光，實現信號放大，結果表明在最優條件下該方法對純培養的金黃色葡萄球菌的檢測限可達 15 CFU/mL。Yao等[13]建立了一種基于RCA結合表面增強拉曼散射技術用于檢測水樣本中的副溶血性弧菌，通過雙抗夾心的方式將RCA引物帶入反應體系進行RCA反應，從而產生一條很長的含有重復序列的ssDNA來捕獲Au@Ag探針，提高反應體系中納米粒子的富集量從而增強拉曼信號，該方法的檢測限達到1 CFU/mL。黃夢琪等[21]將滾環擴增和試紙條顯色相結合用于檢測單增李斯特菌，將單增李斯特菌的A mRNA作為引發鏈引發RCA，然后運用酶將擴增的單鏈產物剪切成短片段的ssDNA用于捕獲探針和金標探針的“橋梁”，實現比色檢測，在最優條件下檢測限達到100 pg/μL。該方法可在幾個小時內完成檢測，在現場檢測中具有較大的應用前景。本實驗室前期建立了多個基于分子生物學和核酸信號放大的方法用于致病菌檢測[22-24]，并建立了基于LRCA檢測單增李斯特菌的方法。

3.2 核酸腫瘤標記物檢測

微小核糖核酸 (MiRNAs) 是一類在轉錄后水平調控基因表達的內源性的非編碼單鏈RNA分子[25]，研究表明MiRNAs的異常表達與一些癌癥 (肺癌、胃癌、乳腺癌等) 的發生具有密切聯系，已被當作新型的腫瘤標記物，快速、靈敏和準確地檢測MiRNAs，具有很高的應用前景[26]。Xu等[27]將回文DNA的互補序列設計在RCA模板上，通過Let-7a引發RCA反應產生大量的含有回文序列ssDNA，回文序列自身折疊形成含有雙鏈結構的發卡DNA，SYBR Green I嵌入雙鏈中產生強熒光信號實現檢測，結果表明該方法在最佳條件下檢測限達6.4 pmol/L。Jiang等[4]建立了一種基于G-四鏈體熒光結合HRCA用于檢測Let-7a，通過目的片段設計含有G-四鏈體和酶切位點的鎖式探針，加入Let-7a引發RCA反應，產生大量的單鏈DNA片段并且被限制酶切割成不同的片段進一步引發RCA反應，產生大量富含G-四鏈體DNA片段。THT嵌入G-四鏈體序列產生強熒光信號達到檢測的目的，結果表明，該方法對Let-7a的檢測限為4 amol/L，線性范圍為 10 amol/L–1 nmol/L。Zhou等[28]建立了一種基于鏈置換反應與RCA相結合的雙信號放大方法用于檢測MiR-21，通過鏈置換反應產生大量的RCA引發鏈用于引發RCA反應，加入SYBR Green II染料與ssDNA結合產生熒光實現檢測，檢測限達到1.0 fmol/L。

3.3 蛋白質的檢測

蛋白質作為生命體中重要的生物大分子，既能調控細胞代謝，又能作為目標分子用于監控疾病，因此，對蛋白質進行超靈敏的檢測在臨床診斷、病理學和遺傳學等領域具有重要的作用[29]。Huang等[11]建立了一種基于HRCA結合G-四鏈體熒光傳感器方法用于檢測DNA甲基化酶，平末端發卡探針在T4 DNA連接酶作用下連接成啞鈴狀模板。當體系中不存在DNA甲基化酶時，限制性內切酶將啞鈴狀模板中的雙鏈切割成不完整的環狀DNA進而限制RCA反應，當加入DNA甲基化酶后，啞鈴狀的環狀模板保持原有的結構，因而能引發RCA反應產生大量的G-四鏈體序列用于后續熒光檢測。結果表明該方法的線性范圍在0.008–50 U/mL，且檢測限達到0.001 1 U/mL。Chen等[15]建立了一種基于RCA結合AuNPs比色的方法來檢測甲胎蛋白，通過夾心模式將RCA體系帶入酶標孔中，引發RCA反應，吸取上清液中未反應的鎖式探針加入到AuNPs溶液中進行金保護，測定吸光度658/520對目標物進行定量。該方法能夠特異性地檢測甲胎蛋白且檢測限為33.45 pg/mL，通過改變不同的抗體，該方法可用于檢測不同的蛋白和病毒，具有較好的應用前景。

3.4 生物小分子檢測

生物小分子的靈敏檢測在臨床檢查、環境監測和食品安全等領域極其重要，開發快速高效的檢測方法意義重大。Zhang等[17]建立了一種光電化學傳感器方法用于快速、靈敏地檢測前列腺抗原 (Prostate-specific antigen，PSA)，通過免疫學反應將引發鏈帶入反應體系發生RCA反應，產生大量的富含G-四鏈體序列的DNA，加入氯化血紅素形成過氧化物酶用于催化化學反應，從而使電極板上的電子傳遞受到阻礙產生電化學信號變化實現檢測。在最優條件下該方法對PSA的檢測限達到1.8 pg/mL。Lee等[30]將磁分離與RCA相結合用于PSA檢測，特異性的PSA適配子作為磁珠和RCA產物的“橋梁”，并且引發RCA反應產生大量的G-四鏈體序列，加入甲基藍染料結合G-四鏈體序列實現檢測，該方法在PSA濃度為100 fmol/L–10 nmol/L時呈現很好的線性關系且檢測限達到22.3 fmol/L。Huang等[18]建立了一種基于RCA信號放大的新型的電化學傳感器用于快速靈敏地檢測赭曲霉毒素A (Ochratoxin A，OTA)，該研究通過引入RCA放大體系使得更多的分子信標固定在金電極板用于電化學檢測，在最優的條件下，OTA的檢測限為0.065 pg/mL，并且該方法能成功應用在酒樣本的檢測中，通過選用不同的適配子，該方法也能夠檢測其他的毒素，具有較好的應用前景。

3.5 病毒的檢測

病毒一直是人類健康的主要威脅之一，病毒的快速檢測對預防和控制病毒具有重大意義。Kim等[19]將聚合酶鏈式反應 (Polymerase chain reaction，PCR) 與RCA結合用于超靈敏檢測流感病毒，通過設計特異性的針對流感病毒的上下游引物引發PCR反應，產生大量的雙鏈DNA，然后用外切酶對雙鏈DNA進行剪切，從而獲取ssDNA。再根據獲取的ssDNA設計啞鈴狀探針，引發RCA反應產生大量的G-四鏈體序列用于熒光檢測。結果表明，將這兩種方法結合能明顯提高檢測靈敏度和特異性，其檢測限達到4.9 amol/L，線性范圍在450 amol/L–450 fmol/L。Huang等[31]建立一種循環鏈置換反應結合RCA電化學傳感器用于檢測B型乙肝病毒，將特異性的B型乙肝病毒DNA作為金電極板和RCA引發鏈的“橋梁”，在DNA聚合酶的作用下引發鏈延伸將B型乙肝病毒DNA置換下來從而充當下一個“橋梁”。加入鎖式探針引發RCA反應產生大量的ssDNA固定在金電極板上用于負載大量的亞甲基藍，實現電化學的檢測。結果表明該方法對B型乙肝病毒的檢測限達2.6 amol/L，線性范圍為10–700 amol/L。

4 討論

4.1 RCA技術優勢與不足

隨著分子生物學的快速發展，核酸恒溫擴增技術已廣泛應用于生物檢測，例如雜交鏈式反應 (Hybridization chain reaction，HCR)、催化型發卡結構自組裝反應 (Catalytic hairpin assembly，CHA)、鏈置換擴增技術 (Strand displacement amplification，SDA) 和環介導等溫擴增技術 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 等[32-35]，這些恒溫擴增技術各有特點，可根據酶的使用條件分為無酶擴增和耗酶擴增。無酶擴增包括HCR和CHA等，耗酶擴增包括SDA和LAMP等。相比無酶擴增，RCA反應在設計上較前兩者簡單，且擴增產物ssDNA能與探針直接結合實現信號放大。相比耗酶擴增，SDA產物多樣 (單鏈和雙鏈)，電泳檢測時有拖尾現象，且SDA產物的兩端必須帶有核酸內切酶的識別序列。而LAMP反應對引物要求較高，易形成氣溶膠造成假陽性結果，且不適合進行長鏈DNA的擴增。相比之下，LRCA產物為一條長的ssDNA，產物較為單一，且反應不需要過多的引物引發。

然而RCA也存在一些問題，需要不斷改進：1) RCA反應發生的關鍵在于構建完整的單鏈環用于后續擴增，構建成環反應的關鍵在于運用DNA連接酶將ssDNA連接成環，然而DNA連接酶對反應體系要求較高，當反應體系中NaCl或KCl的濃度超過200 mmol/L時，可強烈抑制DNA連接酶活性。因此，預先構建一個完整的環狀探針能有效預防后續反應體系對連接酶的影響。2) RCA操作繁瑣，反應中需要磷酸化的DNA用于構建環，且反應過程中需要消耗價格昂貴的酶，成本較高，難以滿足廉價檢測的需求。3) 均相反應體系中多余的鎖式探針和模板DNA會產生較強的背景信號，對檢測限產生影響，使用核酸外切酶能夠有效去除部分背景信號，但價格昂貴。4) RCA反應需要數個小時，難以滿足快速檢測的需求。因此，作為一種恒溫擴增技術，RCA還應在探針的設計、背景的消除、成本和時間等方面作進一步的探索研究。

4.2 RCA的改進方法

經RCA擴增產生的大量ssDNA，與染色劑或探針聯用可實現檢測信號的放大。另外，在RCA反應體系中采用功能性的dNTPs和DNA納米花結構，也對檢測的靈敏度和檢測時間大有改善。

4.2.1 運用功能化的dNTP

RCA擴增產物是由多個重復序列的ssDNA組成，每段重復序列可以搭載檢測探針并固定一個信號分子。為了進一步提高檢測的靈敏度，運用功能化的dNTPs可以增加信號的負載量[36]。如圖3A所示，通過將Cy5標記的dCTP運用到反應體系中，經過RCA反應后，擴增產物中C堿基都帶有熒光探針Cy5，大大提高了檢測的靈敏度。

4.2.2 構建DNA納米花

RCA必須經過數小時的反應時間才能產生用于搭載信號探針的ssDNA，難以滿足快速檢測的需求。預先構建一個完整的RCA產物用于后續信號放大可以減少在實際檢測中RCA擴增耗費的時間，如圖3B所示，通過將功能化的dNTPs運用到RCA反應體系中產生大量富含功能化的RCA產物，當產物中DNA達到一定濃度時，生成的產物與溶液中不溶的鹽離子結合形成結晶，從而得到功能化的DNA納米花[37]。所形成的納米花上富含大量的功能性位點，能夠直接用于實際檢測，擺脫了反應時間的限制。同時，也可以在RCA反應過程中加入蛋白質 (圖3C)，從而將蛋白質固定在DNA納米花中用于后續的檢測[38-39]。

圖3 RCA方法的改進

5 結論

作為一種快速且恒溫的DNA擴增技術，RCA擴增得到的大量ssDNA可用于搭載一系列的信號分子實現檢測信號的放大，在微生物檢測、疾病預防和環境監測等領域都得到了廣泛應用。相信隨著技術水平的不斷提高，RCA定會得到更廣泛和實際的應用。

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Progress in rolling circle amplification in biological detection

Zhongxu Zhan, Ju Liu, Bolu Chen, Yizhou Tang, Guanhua Chen, and Hengyi Xu

State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, Jiangxi, China

Rolling circle amplification is a rapid, sensitive and isothermal single-stranded DNA amplification technique that can be used with staining or probes to amplify the detection signal. This technology has been widely used in biological detection and other aspects. The present paper introduces how to design rolling circle amplification, summarize its application in the detection of pathogens, nucleic acid tumor markers, proteins, biological small biomolecules, and viruses in recent years and prospects for future development.

rolling circle amplification, isothermal, biological detection

November 17, 2018;

January 16, 2019

Research Foundation from State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, China (No. SKLF-ZZB-201720).

Hengyi Xu. Tel: +86-791-88304447/99520; Fax: +86-791-88304400; E-mail: kidyxu@163.com, HengyiXu@ncu.edu.cn

南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室研究基金（No. SKLF-ZZB-201720）資助。

2019-02-19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190218.0957.003.html

占忠旭, 劉巨, 陳博璐, 等. 滾環擴增信號放大技術在生物檢測中應用的研究進展. 生物工程學報, 2019, 35(7): 1206–1213.

Zhan ZX, Liu J, Chen BL, et al. Progress in rolling circle amplification in biological detection. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1206–1213.

(本文責編 陳宏宇)