酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮酸的研究進(jìn)展

張權(quán)，宋偉，張燦，裴杉杉,2，陳修來，劉佳，羅秋玲，劉立明

酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮酸的研究進(jìn)展

張權(quán)1,3，宋偉1，張燦1，裴杉杉1,2，陳修來1，劉佳1，羅秋玲1,3，劉立明1

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122 3 無錫宸明生物科技有限公司，江蘇 無錫 214122

α-酮酸是一種同時含有羧基和酮基的雙官能團(tuán)有機(jī)化合物，廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等行業(yè)。為了滿足環(huán)境友好、安全高效和可持續(xù)發(fā)展的社會要求，利用酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)α-酮酸受到人們的廣泛關(guān)注。文中從酶的篩選、酶的改造以及酶的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化3個方面介紹丙酮酸、α-酮戊二酸、酮亮氨酸、酮纈氨酸、苯丙酮酸和酮蛋氨酸酶法合成的研究狀況，并展望了α-酮酸進(jìn)一步高效生產(chǎn)的發(fā)展方向。

α-酮酸，酶轉(zhuǎn)化，蛋白質(zhì)工程

酮酸是一類同時含有羧基和酮基的雙官能團(tuán)有機(jī)化合物。根據(jù)分子中羧基和酮基的相對位置可以將其分為α-酮酸和β-酮酸。其中α-酮酸包括丙酮酸、α-酮戊二酸、酮亮氨酸、酮纈氨酸、苯丙酮酸和酮蛋氨酸等。α-酮酸是有機(jī)藥物合成及生物合成的重要中間體，已廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工和化妝品等領(lǐng)域。

目前，α-酮酸的生產(chǎn)技術(shù)主要可以分為化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法3種。化學(xué)合成法是指某些特定的化學(xué)物質(zhì)在苛刻的反應(yīng)條件下生成目標(biāo)產(chǎn)物，主要包括氧化法、水解法、雙羰基化法和海因法等，化學(xué)法以一氯戊烷和一氧化碳為底物，八羰基二鈷和鈀絡(luò)合物為催化劑在60 ℃條件下合成α-酮亮氨酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了71.1%[1]。但是反應(yīng)過程中原料昂貴且復(fù)雜，工藝繁瑣，反應(yīng)條件苛刻不易被人們采用。發(fā)酵法指微生物直接發(fā)酵糖質(zhì)原料或其他碳源生成α-酮酸。但是采用直接發(fā)酵法生產(chǎn)某些α-酮酸時產(chǎn)量較低，底物轉(zhuǎn)化率低，比如α-酮亮氨酸的碳酸轉(zhuǎn)化率僅僅達(dá)到了0.17 g α-酮亮氨酸/g葡萄糖，難以滿足工業(yè)化的要求[2-3]。酶轉(zhuǎn)化法指利用微生物中某些酶高選擇性的催化性質(zhì)，將底物特定分子氨基酸催化轉(zhuǎn)化為價值更高的α-酮酸 (圖1)。在部分α-酮酸的合成過程中，酶轉(zhuǎn)化法與其他方法相比具有獨特的優(yōu)勢，比如高選擇性、高效性、無毒、低污染等特點。

近年來，酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮酸已經(jīng)成為研究熱點，總結(jié)于表1。本綜述以丙酮酸、α-酮戊二酸、酮亮氨酸、酮纈氨酸、苯丙酮酸和酮蛋氨酸為目標(biāo)產(chǎn)物，從酶的篩選、酶的改造以及酶的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化3個方面詳細(xì)論述α-酮酸酶法合成的研究狀況，并對未來α-酮酸的高效生產(chǎn)進(jìn)行了展望。

1 丙酮酸

丙酮酸 (Pyruvic acid, PA) 又稱α-氧代丙酸，是在α碳上含有羰基的三碳一羧酸化合物，分子式為C3H4O3，相對分子質(zhì)量為88.06。丙酮酸是許多酶催化的中間代謝物，參與體內(nèi)的TCA循環(huán)，對于維持體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)也發(fā)揮重要的作用，此外，丙酮酸還是一種重要的工業(yè)原料[21]。

1.1 酶的篩選

酶轉(zhuǎn)化法合成丙酮酸的底物包括乳酸和丙氨酸。當(dāng)以乳酸為底物時，涉及的酶包括L-乳酸氧化酶 (L-lactate oxidase，LOD，EC 1.1.3.2)、乳酸脫氫酶 (Lactate dehydrogenase，LDH，EC 1.1.1.27) 和乙醇酸氧化酶 (Glycolate oxidase，GO，EC 1.1.3.15)。谷勁松等從土壤樣品中富集、篩選和純化獲得乳酸氧化酶的菌株SM-10#、SM-29#、SM-14#，總酶活力為1 469.50、1 310.64、1 103.55 U/mL。LDH借助輔酶的氧化型或還原型 (NAD+或NADH) 在糖酵解過程中參與乳酸和丙酮酸的可逆轉(zhuǎn)化[22]。郁書懷在乳酸片球菌和戊糖片球菌中克隆基因并在中實現(xiàn)了表達(dá)，對丙酮酸的比活性分別為422.1和835 U/mg，cat/m值分別為3 157和658 mmol/(L·S)[23]。趙婷從副干酪乳桿菌W2中克隆了基因，表達(dá)成功后對丙酮酸具有較高的酶活性[24]。乙醇酸氧化酶能將乳酸氧化為丙酮酸，并伴隨過氧化氫的生成，此過程以FMN為輔酶，氧氣作為最終的電子受體[25]。Amy利用多形漢遜酵母和畢赤酵母分別表達(dá)來源于菠菜的乙醇酸氧化酶。當(dāng)pH為8.0時，乙醇酸氧化酶活性最高，L-乳酸和丙酮酸對應(yīng)的pKa分別為3.79和2.49，并且發(fā)現(xiàn)L-乳酸不會對該酶產(chǎn)生抑制效應(yīng)，而底物丙酮酸會抑制該酶的活性[25]。

當(dāng)以丙氨酸為底物時，主要包括L-丙氨酸脫氫酶 (Alanine dehydrogenase，ALDH，EC1.4.1.1)、L-氨基酸脫氨酶和氨基酸氧化酶。研究表明，來源于產(chǎn)氣腸桿菌的丙氨酸脫氫酶分別以丙氨酸和丙酮酸為底物進(jìn)行催化反應(yīng)時，最適pH為10.9和8.7。對丙氨酸、NAD+、丙酮酸、NADH和氨的m值分別為0.47、0.16、0.22、0.067和66.7 mmol/L[26]。L-氨基酸脫氨酶催化的氧化脫氨反應(yīng)主要是酶與細(xì)胞膜上電子傳遞鏈相關(guān)，電子經(jīng)過電子傳遞鏈傳遞給細(xì)胞色素氧化酶，使分子氧還原為水，生成α-酮酸和氨[27]。L-氨基酸氧化酶是利用分子氧直接氧化還原型的FAD，再生成氧化型的FAD，生成過氧化氫、α-酮酸和氨[28]。

圖1 酶法轉(zhuǎn)化氨基酸合成α酮酸

表1 酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)α-酮酸

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1.2 酶的表達(dá)與改造

2016年，Hossain等以大腸桿菌BL21 (DE3)為表達(dá)宿主，表達(dá)來自奇異變形桿菌的L-氨基酸脫氨酶基因，構(gòu)建了重組菌株pET-20b(+)-pm1 (BL21)，丙氨酸經(jīng)過全細(xì)胞轉(zhuǎn)化丙酮酸的產(chǎn)量達(dá)到了1.14 g/L[4]。為了阻斷丙氨酸和丙酮酸的去路，敲除了基因、和，丙酮酸的產(chǎn)量進(jìn)一步得到提高，達(dá)到了5.38 g/L。為了提高轉(zhuǎn)氨酶的催化效率，Hossain等對進(jìn)行了定向進(jìn)化，經(jīng)過3輪易錯PCR，得到了突變體pm1ep3，使得丙酮酸的產(chǎn)量達(dá)到了14.57 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了29.14%[4]。該突變體對L-丙氨酸的親和力 (m) 和催化效率 (cat/m) 分別提高至6.76 mmol/L和0.085 mmol/(L·s)。上述結(jié)果表明，酶轉(zhuǎn)化技術(shù)結(jié)合定向進(jìn)化策略和代謝工程策略可以顯著提高丙酮酸的產(chǎn)量。Simona等將來源于紅酵母的氨基酸氧化酶用于丙氨酸的轉(zhuǎn)化實驗，最終轉(zhuǎn)化率達(dá)到了90%以上[29]。

乳酸脫氫酶可以催化乳酸生成丙酮酸。Ping Xu課題組以假單胞桿菌SDM為出發(fā)菌株，以25.5 g/L的D/L-乳酸為底物，轉(zhuǎn)化24 h，丙酮酸的產(chǎn)量達(dá)到了22.6 g/L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)88.6%[30]。

2 α-酮戊二酸

α-酮戊二酸 (α-ketoglutaric acid, α-KG) 是戊二酸的兩種含酮基衍生物中的一種，分子式為C5H6O5，相對分子質(zhì)量為146.1。α-KG是連接微生物細(xì)胞碳-氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點，是微生物三羧酸循環(huán)中重要的代謝中間物，在氨基酸形成和氮轉(zhuǎn)運(yùn)中扮演著重要的角色[31]。α-KG作為保健品原料，增加蛋白質(zhì)的合成，作為飼料添加劑可以緩解免疫性應(yīng)激對畜牧氨基代謝的影響[32]。

2.1 酶的篩選

以L-谷氨酸為底物酶法合成α-KG的酶包括谷氨酸脫氫酶 (Glutamate dehydrogenase，GDH)、L-氨基酸脫氨酶 (L-amino acid deaminase) 和L-谷氨酸氧化酶 (L-glutamate oxidase，LGOX，EC：1.4.3.11)。Paul等以黃化瘤胃球菌FD1為出發(fā)菌株，純化并研究了谷氨酸脫氫酶 (EC：1.4.1.4) 的性質(zhì)，該酶以NADP+輔酶，在0.5 mol/L KCl溶液中的最適pH為6.9–7.0，對NH3、α-KG、谷氨酸的m值分別為19、0.41、62 mmol/L[33]。此外，張克旭等研究了天津短桿菌T6-13谷氨酸脫氫酶的特性，研究表明，該酶對還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、α-KG、NH3、谷氨酸的m值分別為0.076、3.23、4.0、120.48 mmol/L。并且該酶受反應(yīng)產(chǎn)物的抑制，正反應(yīng)受NADPH、α-KG和NH4+的抑制，逆反應(yīng)受NADP+和谷氨酸的抑制[34]。

LGOX是一種核黃素酶，是以FAD為輔酶，在不添加外源性輔助因子的條件下，專一性地將L-谷氨酸氧化脫氨，生成氨、α-KG和過氧化氫。研究者測定了來源于鏈霉菌屬、sp. 18G和sp. X-119-6的LGOX的生化特性[35-37]。LGOX的蛋白大小分別為90、120、77 kDa，比酶活分別為0.0024、0.15、0.056 U/mL。來源于的LGOXm值最大為1.1 mmol/L。Amina等還對sp. X-119-6中的LGOX晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白活性部位在蛋白中心、底物和產(chǎn)物進(jìn)出通道較窄，并且活性部位殘基不同造成底物專一性強(qiáng)[38]。

2.2 酶的表達(dá)與改造

2014年，Hossain等以枯草芽孢桿菌168和BL21 (DE3) 為表達(dá)宿主，表達(dá)來自KCTC2566的L-氨基酸脫氨酶基因，構(gòu)建了重組菌株pHT43-pmAAD ()和pET-20b(+)-pmAAD (BL21)。通過以L-谷氨酸為底物進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化24 h，重組菌株pHT43-pmAAD ()轉(zhuǎn)化率優(yōu)于pET-20b(+)-pmAAD (BL21)，α-KG產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了4.65 g/L和31%[6]，其原因可能是可以去除錯誤折疊和不完整的蛋白來促進(jìn)高質(zhì)量蛋白的合成。為了提高pmAAD的催化效率，Hossain等在前期的基礎(chǔ)上對pmAAD進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造。首先，通過易錯PCR手段確定了影響催化效率的6個關(guān)鍵點，分別為F110、A255、E349、R228、T249和I352，隨后，采用定點飽和突變的方法將6個位點分別突變?yōu)镕110I、A255T、E349D、R228C、T249S和I352A，α-KG的產(chǎn)量從之前的4.65 g/L提高到了10.08 g/L，轉(zhuǎn)化率從31%提高到了83.25%，此時，酶的親和效率也有所提高 (m值從49.21 mmol/L降低到了23.58 mmol/L)[7]。最后，Hossain等采用Cre/lox無痕敲除系統(tǒng)阻斷了中α-KG的降解路徑，α-KG的產(chǎn)量得以提高，達(dá)到了12.21 g/L。上述研究表明，蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)能夠增強(qiáng)底物特異性和催化速率，進(jìn)而提高α-KG的產(chǎn)量。

利用LGOX催化L-谷氨酸生成α-酮戊二酸的過程會產(chǎn)生大量的H2O2，該副產(chǎn)物不僅能影響菌體的生長還能抑制LGOX的活性，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行，常常需要通過外源添加過氧化氫酶才能夠保證轉(zhuǎn)化反應(yīng)的順利進(jìn)行，此舉提高了原料的成本。因此如何解決H2O2的添加問題成為酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸的關(guān)鍵問題之一。為了解決上述H2O2積聚問題，Wu等將來源于K12 W3110的過氧化氫酶基因異源表達(dá)于BL21 (DE3)中，并結(jié)合重組酶LGOX和KatG的生化性質(zhì)，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平構(gòu)建了LGOX和KatG共表達(dá)菌株[10]。在轉(zhuǎn)錄水平上，以pET28a為表達(dá)載體設(shè)定了3種不同策略構(gòu)建共表達(dá)菌株F008、FXC008、FXC009，分別為：策略一，采用單啟動模式將LGOX和KatG串聯(lián)表達(dá)，兩個酶分別帶有相同的RBS序列；策略二，采用雙啟動子模式于LGOX和KatG前面添加同樣的啟動子及相關(guān)序列；策略三，采用單啟動子模式將LGOX和KatG通過d Ⅲ直接串聯(lián)在一起。結(jié)果發(fā)現(xiàn)F008更有利于α-KG的生產(chǎn)[10]。隨后，對單啟動子雙酶串聯(lián)表達(dá)菌株中KatG基因前的SD序列與ATG之間的間隔進(jìn)行了優(yōu)化，分別間隔3、6、9、12 bp，獲得重組菌株FXC003、FXC004、FXC005、FXC006，重組菌株FXC005產(chǎn)酶效果和轉(zhuǎn)化效果最優(yōu)，α-KG產(chǎn)量達(dá)到了86.7 g/L，轉(zhuǎn)化率為79.6%[10]。在翻譯水平上，通過預(yù)測合適起始翻譯速率的RBS序列以提高KatG有效表達(dá)量，構(gòu)建重組菌株F006。重組菌株F006 α-KG產(chǎn)量達(dá)到了103.1 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了94.6%，實現(xiàn)了不添加過氧化氫酶高效生產(chǎn)α-酮戊二酸[10]。上述結(jié)果表明，借助啟動子工程策略優(yōu)化多酶級聯(lián)催化反應(yīng)可以平衡H2O2的合成與消耗問題，從而提高α-KG的產(chǎn)量。

2.3 酶的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

在轉(zhuǎn)化體系中添加過氧化氫酶解除過氧化氫對LGOX的抑制作用。牛盼清等通過優(yōu)化底物L(fēng)-谷氨酸的濃度與H2O2酶的添加量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)L-谷氨酸濃度與H2O2酶酶活的最適比例為12∶5 (g∶kV)，此時α-KG產(chǎn)量為32.9 g/L，較優(yōu)化前提高了126.9%[39]。此外，Mn2+對LGOX有激活作用，牛盼清等研究了在轉(zhuǎn)化過程中不同濃度的Mn2+對α-KG產(chǎn)量的影響。研究表明，當(dāng)MnCl2的添加量為5 mmol/L時，轉(zhuǎn)化24 h，α-KG產(chǎn)量達(dá)到最高38.1 g/L，較未添加Mn2+提高了15.8%[39]。樊祥臣也研究了Mn2+濃度對α-KG產(chǎn)量的影響，當(dāng)Mn2+濃度為1 mmol/L時，結(jié)合正交實驗最優(yōu)的結(jié)果，轉(zhuǎn)化24 h，α-KG的產(chǎn)量達(dá)到最大值127.2 g/L，轉(zhuǎn)化率為97.0%[9]。

3 酮亮氨酸

α-酮異己酸 (α-ketoisocaperate, KIC) 又名α-酮亮氨酸，是亮氨酸的前體物質(zhì)，分子式為C6H10O3，相對分子質(zhì)量為130.14。α-酮亮氨酸作為生理必需物質(zhì)，對氨基酸代謝具有平衡和刺激的作用，同時α-酮亮氨酸也可以作為氨基酸的替代物質(zhì)，降低生物體內(nèi)的氮代謝負(fù)擔(dān)。在臨床中，α-酮亮氨酸飲食療法治療肝腎病患者體內(nèi)代謝的紊亂，保健品中可作為運(yùn)動補(bǔ)充劑提高健身效果。在動物飼料中，適量加入α-酮亮氨酸可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)蛋白質(zhì)積累與家畜生長，提高動物免疫力。

3.1 酶的篩選

以L-亮氨酸為底物催化合成α-酮亮氨酸的酶為L-氨基酸脫氨酶，是一類以FAD為輔酶的黃素蛋白，可以催化L-亮氨酸脫氨形成α-酮亮氨酸和氨。L-氨基酸脫氨酶來源廣泛，包括蛇毒、不透明紅球菌、鏈霉菌和變形桿菌等。其中，結(jié)構(gòu)功能研究最徹底的來源于蛇毒的L-氨基酸脫氨酶難以異源表達(dá)，不利于工業(yè)化制備和應(yīng)用，來源于紅球菌的L-氨基酸脫氨酶將氨基酸脫氨后會形成過氧化氫，并且生產(chǎn)周期較長，也不適合制備α-酮亮氨酸。因此，來源于變形桿菌的L-氨基酸脫氨酶定位在細(xì)胞膜上，采用非典型的脫氨機(jī)制將L-亮氨酸脫氨成α-酮亮氨酸具有非常大的優(yōu)勢。然而，來源于不同變形桿菌的L-氨基酸脫氨酶對底物L(fēng)-亮氨酸的轉(zhuǎn)化效率也存在著差異，來自的L-氨基酸脫氨酶 (Ladf) 的轉(zhuǎn)化效率為99.2%[40]，來自的L-氨基酸脫氨酶 (Pma、Pml) 的轉(zhuǎn)化效率卻只有41.7%和7.6%[41-42]。宋陽測定了來源的L-氨基酸脫氨酶的酶學(xué)性質(zhì)，m為17.71 mmol/L，Vmax為1.62 μmol/(L·min·mg)，cat值為1.41 s–1[43]。

3.2 酶的表達(dá)與改造

2011年，Zhu等首次利用不透明紅球菌DSM 43250自身合成L-氨基酸脫氨酶催化L-亮氨酸合成α-酮亮氨酸，并且取得了成功，采用響應(yīng)面分析的方法對菌體培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化后，α-酮亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了1.27 g/L[11]。為了提高α-酮亮氨酸的產(chǎn)量，研究者們選擇了變形桿菌屬來源的L-氨基酸脫氨酶。Song和劉立明分別將來源于普通變形桿菌和奇異變形桿菌的L-氨基酸脫氨酶克隆至表達(dá)載體pET-28a上，轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主BL21(DE3) 后均能檢測到L-氨基酸脫氨酶的活性[12-14]。

為了進(jìn)一步提高L-氨基酸脫氨酶的表達(dá)量，Song等對其轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平進(jìn)行了調(diào)控，通過對非編碼區(qū)的RBS序列優(yōu)化控制翻譯的起始速率，通過改變質(zhì)粒拷貝數(shù)影響轉(zhuǎn)錄水平，α-酮亮氨酸的產(chǎn)量得到了大幅度的提高，達(dá)到了86.55 g/L[14]。雖然α-酮亮氨酸的產(chǎn)量得到了大幅度的提高但是其轉(zhuǎn)化率為94.25%，還有進(jìn)一步上升的空間。針對上述轉(zhuǎn)化率低的問題，劉立明課題組對L-氨基酸氧化酶進(jìn)行了蛋白質(zhì)工程改造，首先在奇異變形桿菌L-氨基酸脫氨酶同源建模的基礎(chǔ)上，通過分析確定了突變位點T436A，突變體T436A α-酮亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了106.2 g/L，轉(zhuǎn)化率為97.7%，此突變體T436對L-亮氨酸的催化效率較原L-氨基酸脫氨酶提高了72.7%[13]。此研究工作增強(qiáng)了α-酮亮氨酸的工業(yè)應(yīng)用價值。

3.3 酶的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

在大腸桿菌細(xì)胞中存在兩種亮氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。高親和性的分支氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)LivFGHMJ和LivFGHMK是細(xì)胞膜上的ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)家族的組成部分。LivJ可轉(zhuǎn)運(yùn)亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸3種支鏈氨基酸，LivK專一性地轉(zhuǎn)運(yùn)L-亮氨酸，BrnQ需要鈉離子梯度電勢。因此，為了減少L-亮氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，宋陽等采用不同濃度的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑3-羰基氰酯 (Cyanide-3-chlorophenylhydrazone, CCCP) 抑制、和的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，提高了酶的轉(zhuǎn)化效率。但是CCCP價格昂貴，未來可以通過基因敲除的策略敲除和基因以降低生產(chǎn)成本[43]。

4 酮纈氨酸

α-酮異戊酸 (α-ketoisovalerate, α-KIV) 又名酮纈氨酸，是纈氨酸的前體物質(zhì)，分子式為C5H8O3，相對分子質(zhì)量為116.12。作為支鏈酮酸的一種，α-酮異戊酸是重要的中間體，它主要應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。在飼料內(nèi)加入酮纈氨酸可以促進(jìn)家畜的肌肉生長。同時α-酮酸具有降低腎過濾壓力的效果，可用于治療慢性尿毒癥和氮代謝的相關(guān)疾病。

4.1 酶的篩選

以L-纈氨酸為底物酶轉(zhuǎn)化法合成酮纈氨酸所用的酶包括氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶、L-氨基酸氧化酶和L-氨基酸脫氨酶。氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶通常以α-酮戊二酸和纈氨酸為底物生成對應(yīng)的酮纈氨酸和谷氨酸，該方法添加α-酮戊二酸增加了成本，副產(chǎn)物谷氨酸的出現(xiàn)增加了后續(xù)的純化分離步驟，因此，研究者更傾向于選擇L-氨基酸氧化酶和L-氨基酸脫氨酶。然而，文獻(xiàn)報道L-氨基酸脫氨酶和L-氨基酸氧化酶催化L-纈氨酸生成α-酮纈氨酸的催化效率都比較低[41-42]。吳靜等選取的L-氨基酸氧化酶的催化效率是目前文獻(xiàn)中報道最高的，達(dá)到了84.6%[17]。

4.2 酶的表達(dá)與改造

Li等在BL21(DE3)中建立了酶轉(zhuǎn)化體系合成酮纈氨酸。表達(dá)來自的L-氨基酸脫氨酶基因，構(gòu)建了重組菌株BL21 ()，為了提高底物L(fēng)-纈氨酸的利用率，繼續(xù)敲除了細(xì)胞膜支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因，得到了重組菌株BL21 (△△,)，此菌株以5 g/L的L-纈氨酸為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗得到了0.585 g/L的酮纈氨酸[15]。吳靜等同樣以BL21作為表達(dá)宿主表達(dá)L-氨基酸氧化酶，構(gòu)建了重組菌株BL21-LAAO，α-酮纈氨酸的產(chǎn)量最高可達(dá)51 g/L，轉(zhuǎn)化率為79.1%。

為了提高L-氨基酸脫氨酶的催化效率，Li等借助了蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)對L-氨基酸脫氨酶進(jìn)行了改造[15]。首先，根據(jù)同源建模和分子對接分析確定了4個關(guān)鍵氨基酸位點F318、R316、N100和Q276，然后對這4個位點進(jìn)行飽和突變得到最優(yōu)單突變體F318T。在此基礎(chǔ)之上，對F318T進(jìn)行N100飽和突變，得到最優(yōu)突變體N100H，其轉(zhuǎn)化效率比F318T提高了28.24%；最后在F318T/N100H的基礎(chǔ)上對Q276進(jìn)行飽和突變，三突變體F318T/N100H/Q276E的產(chǎn)量為8.197 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到72.54%，轉(zhuǎn)化時間縮短至10 h[15]。上述研究中對L-氨基酸脫氨酶的改造工作一定程度上提高了酶的催化效率。

4.3 酶的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

在酶催化過程中酶的轉(zhuǎn)化效率會受到溫度、pH、金屬離子、催化劑濃度的影響，甚至反應(yīng)體系的大小也會影響酶催化的效率。Li等[15]和吳靜等[16]分別對轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化pH和金屬離子進(jìn)行了優(yōu)化。重組菌株(pET20b-，△△)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-纈氨酸的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為pH 6.5、底物濃度為100 mmol/L、菌體量為10 g/L DCW細(xì)胞，轉(zhuǎn)化12 h，α-酮異戊酸的產(chǎn)量達(dá)到了1.49 g/L[15]。重組菌株BL21-LAAO的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為25 ℃、pH 8.0、菌體量為30 g/L濕菌體，轉(zhuǎn)化24 h，α-酮異戊酸的產(chǎn)量最高可達(dá)51 g/L，轉(zhuǎn)化率為79.1%，大幅度提高了生產(chǎn)效率，實現(xiàn)了L-纈氨酸向α-酮纈氨酸的高效合成[16]。

5 苯丙酮酸

α-苯丙酮酸 (Phenylpyruvic acid, PPA) 是一種含有雙羰基的多功能有機(jī)酸，分子式為C9H8O3，相對分子質(zhì)量為164.16。PPA作為苯丙氨酸合成的原材料，苯丙氨酸是合成手性藥物的重要中間體。

5.1 酶的篩選

D-氨基酸氧化酶以D-苯丙氨酸為底物催化合成苯丙酮酸，D-氨基酸氧化酶主要來源于三角酵母、畢赤酵母和紅酵母。此外，以L-苯丙氨酸為底物催化合成苯丙酮酸的酶包括苯丙氨酸脫氫酶、氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶和L-氨基酸脫氨酶。對于氨基酸脫氫酶，需要構(gòu)建輔酶NAD+再生系統(tǒng)。而且苯丙氨酸脫氫酶一般屬于胞內(nèi)酶，構(gòu)建全細(xì)胞催化劑后，不利于底物和酶的結(jié)合。L-氨基酸脫氨酶反應(yīng)只需一種氨基酸參與反應(yīng)，無需外源添加輔酶或構(gòu)建輔酶再生系統(tǒng)。因此，L-氨基酸脫氨酶成為催化苯丙酮酸的最佳選擇。L-氨基酸脫氨酶的來源主要包括鏈霉屬、變形桿菌屬和紅球菌屬。鏈霉菌屬來源的L-氨基酸脫氨酶具有底物專一性，對L-谷氨酸表現(xiàn)出較高的催化活性，紅球菌屬的L-氨基酸脫氨酶 (L-AAO) 對L-苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化效率為53%[45]，然而變形桿菌來源的L-氨基酸脫氨酶 (Pma) 的催化效率為100%[41]，其突變體M5的m值為33 mmol/L，較野生型的Pma提高了20.88%。

5.2 酶的表達(dá)與改造

Pantaleone課題組建立了酶法生產(chǎn)苯丙酮酸的路徑，在大腸桿菌異源表達(dá)來自KCTC2566的L-氨基酸脫氨酶，通過優(yōu)化條件 (菌體添加量、底物投量等)，最終苯丙酮酸的產(chǎn)量提高至42.50 g/L，轉(zhuǎn)化率為85%[46]。但是，隨著PPA產(chǎn)量的提高，對L-氨基酸脫氨酶有很強(qiáng)的產(chǎn)物抑制，導(dǎo)致產(chǎn)量無法進(jìn)一步提高。產(chǎn)物抑制的原因主要是產(chǎn)物釋放慢，產(chǎn)物與底物競爭性結(jié)合催化位點。劉佳等應(yīng)用構(gòu)象動力學(xué)思想，從產(chǎn)物周圍的loop結(jié)構(gòu)入手，調(diào)節(jié)對結(jié)構(gòu)影響較小的loop上的氨基酸，從而增大產(chǎn)物結(jié)合位點的構(gòu)象動力學(xué)，促進(jìn)產(chǎn)物釋放，減弱產(chǎn)物抑制，達(dá)到提高產(chǎn)量的目的[18]。首先，通過對酶結(jié)構(gòu)的分析選擇了18個氨基酸位點(Y103、T105、S106、D144、E145、R315、I316、F317、E340、L341、V411、S412、T414、F415、E417、T434、T436、V437)，將其突變?yōu)楸彼幔瑯?gòu)建單點突變庫，突變體T105、S412、E417、E340和E145的轉(zhuǎn)化能力得到提高；隨后，采用組合突變的策略，對上述5個有益突變進(jìn)行組合突變，構(gòu)建了部分雙突變體、三突變體、四突變體和五突變體，得到最佳的五突變體為M5 (T105A、S412A、E417A、E340A、E145A)，M5的苯丙酮酸的產(chǎn)量最高，達(dá)到了72.5 g/L，此時底物轉(zhuǎn)化率為96.67%[18]。楊彬等測定了突變體M5的產(chǎn)物抑制常數(shù)和動力學(xué)參數(shù)，產(chǎn)物抑制常數(shù)PI提高到了86.6 g/L，較野生型提高了3.7倍。cat值比野生型增加了2倍，催化效率 (cat/m) 也有所增加，是野生型的1.6倍[47]。

5.3 酶的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

Hou等將來自KCTC 2566中的L-氨基酸脫氨酶基因克隆至pET-20b(+)并且成功轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主BL21(DE3)中，研究了溫度、pH、酶濃度、底物濃度、金屬離子 (Ba+、Mg2+、Li+、Ca2+、Zn2+等)、輔酶FAD的濃度對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成苯丙酮酸的影響。條件優(yōu)化后，轉(zhuǎn)化2.5 h，苯丙酮酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為2.7 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為86.7%[48]。同時，Hou等繼續(xù)研究了兩階段全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，即生長態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，建立了兩階段溫度控制策略，最終在3-L罐上苯丙酮酸的產(chǎn)量為77.6 g/L，苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.3%[49]。劉佳等對L-氨基酸脫氨酶突變體催化制備苯丙酮酸的體系也進(jìn)行了優(yōu)化。首先，對重組大腸桿菌產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括不同的表達(dá)載體 (pET-28a、pET-20b、pET-22b、pET-24a)、不同的培養(yǎng)基 (LB、TB、SB、LBA、TBA、SBA和SOC)、誘導(dǎo)條件 (誘導(dǎo)劑種類、濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間)，然后優(yōu)化了L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯丙酮酸的條件，轉(zhuǎn)化條件包括pH、溫度、底物濃度、催化劑用量和添加劑種類 (CTAB、曲拉通-100、吐溫-80、Mn2+和DMSO)。經(jīng)過條件優(yōu)化后，在30-L罐上苯丙酮酸的最高產(chǎn)量達(dá)到了83.0 g/L，底物轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.20%[18]，該研究的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率為目前報道最高。

6 酮蛋氨酸

酮蛋氨酸 (α-keto-γ-methylthiobutyric acid, KMTB) 又稱α-酮-γ-甲硫基丁酸，是由蛋氨酸脫氨基生成的含酮化合物，分子式為C5H8O3S，分子量為148.21。KMTB作為L-甲硫氨酸的衍生物，不僅可以增加機(jī)體的利用效率還能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，也被用來治療尿毒癥的病人。此外，KMTB還是一種安全無毒的禽畜飼料添加劑。

6.1 酶的篩選

以蛋氨酸為底物酶法合成酮蛋氨酸的酶主要包括L-氨基酸脫氨酶、氨基酸氧化酶和L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶。其中，氨基酸氧化酶和L-氨基酸脫氨酶全細(xì)胞轉(zhuǎn)化都以胞內(nèi)FAD為輔酶，不可逆的催化L-蛋氨酸生成α-亞蛋氨酸，α-亞蛋氨酸由于結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，會自發(fā)水解形成α-酮蛋氨酸和氨。來源于的氨基酸脫氨酶對蛋氨酸的轉(zhuǎn)化效率為100%[50]，而來源于的氨基酸脫氨酶Pma和Pml對蛋氨酸的轉(zhuǎn)化效率只有16.7%和2.6%[41-42]。

6.2 酶的表達(dá)優(yōu)化與改造

2014年，Hossain等建立了酶轉(zhuǎn)化法合成KMTB的方法。以BL21 (DE3) 為表達(dá)宿主，表達(dá)來自的L-氨基酸脫氨酶基因，構(gòu)建了重組菌株pET-20b(+)-pvAAD (BL21)。重組菌株以L-蛋氨酸為底物，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化24 h，KMTB產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了49.5 g/L和71.2%。在此基礎(chǔ)上，Hossain等對pvAAD進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造。首先，通過易錯PCR技術(shù)獲得了2個能提高L-蛋氨酸轉(zhuǎn)化為KMTB效率的突變體K104R和A337S，轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了82.2%和80.8%。隨后，采用組合突變的方法將2個突變位點組合在一起獲得了最佳的突變體pvAADK104R/A337S。KMTB的產(chǎn)量從49.5 g/L提高到了63.6 g/L，轉(zhuǎn)化率從71.2%提高到了91.4%[51]。上述研究表明，蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)能夠增強(qiáng)酶的催化速率，進(jìn)而提高KMTB的產(chǎn)量。

密碼子優(yōu)化能夠提高酶的翻譯，進(jìn)而提高酶的表達(dá)水平。劉立明課題組將來源于紅平紅球菌的L-氨基酸氧化酶經(jīng)過密碼子優(yōu)化后連接pET28a后導(dǎo)入BL21 (DE3) 中進(jìn)行異源表達(dá)。通過對濕菌體的添加量 (30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L)、轉(zhuǎn)化溫度 (15 ℃、20 ℃、30 ℃、37 ℃) 和轉(zhuǎn)化pH (7.0、7.5、8.0、8.5、9.0) 優(yōu)化后，KMTB的產(chǎn)量達(dá)到95.18 g/L，轉(zhuǎn)化率為95.84%，時空產(chǎn)率為3.97 g/(L·h)[20]。

7 結(jié)論與展望

針對酶法轉(zhuǎn)化L-氨基酸生產(chǎn)相應(yīng)的α-酮酸，國內(nèi)外研究人員開展了卓有成效的研究工作。主要包括兩個方面：重組菌株的構(gòu)建，包括酶的篩選、酶的表達(dá)和酶的蛋白質(zhì)工程改造；另一方面為酶轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化。然而，由于酶制劑自身的催化效率低，轉(zhuǎn)化過程條件繁多且復(fù)雜，造成了α-酮酸產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度較低。因此，為了提高α-酮酸的生產(chǎn)效率以及經(jīng)濟(jì)效益，今后需要在以下幾個方面進(jìn)行深入研究。第一，利用蛋白質(zhì)工程改造策略對酶進(jìn)行精準(zhǔn)改造，提高酶的催化效率，從而降低酶的用量，縮短催化反應(yīng)的時間；第二，可以發(fā)展多酶級聯(lián)催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成附加值更高的酮酸衍生物，使得效益最大化；第三，深入研究酶的循環(huán)利用，做到酶制劑的多次重復(fù)利用，以降低生產(chǎn)成本；第四，利用代謝工程策略對表達(dá)宿主進(jìn)行改造，協(xié)調(diào)產(chǎn)物合成路徑與其他競爭性路徑之間的關(guān)系，增強(qiáng)酮酸的合成，為α-酮酸工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅實基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Recent advances in enzymatic production of alpha-keto acids

Quan Zhang1,3, Wei Song1, Can Zhang1, Shanshan Pei1,2, Xiulai Chen1, Jia Liu1, Qiuling Luo1,3, and Liming Liu1

1 State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China2 School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China3 Wuxi Chenming Biotechnology Co., Ltd., Wuxi 214122, Jiangsu, China

Alpha-keto acid is a bifunctional organic compound containing both carboxyl and ketone groups, and widely applied in the industries of food, pharmaceutical and cosmetics. Based on the demand of eco-friendly process, safety and sustainable development, production of α-keto acids by enzymatic conversion technology has been paid more and more attention. In this article, we review the status of α-keto acids biosynthesis from three aspects: enzymatic screening, enzymatic modification and optimization of enzymatic conversion conditions.Meanwhile, we also indicate future research directions for further improving α-keto acids production．

α-keto acids, enzymatic conversion, protein engineering

November 6, 2018;

January 9, 2019

National First-class Discipline Program of Light Industy Technology and Engineering (No. LITE2018-08), Key Technologies R & D Program of Jiangsu Province (No. BE2018623).

Liming Liu. Tel: +86-510-85197357; Fax: +86-510-85197875; E-mail: mingll@jiangnan.edu.cn

國家輕工技術(shù)與工程一流學(xué)科自主課題 (No. LITE2018-08)，江蘇省科技支撐計劃社會發(fā)展項目 (No. BE2018623) 資助。

張權(quán), 宋偉, 張燦, 等. 酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮酸的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(7): 1193–1205.

Zhang Q, Song W, Zhang C, et al. Recent advances in enzymatic production of alpha-keto acids. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1193–1205.