微生物微培養系統研究現狀與展望

陳政霖，馬春玄，邢新會,3，張翀,3

微生物微培養系統研究現狀與展望

陳政霖1,2，馬春玄1,2，邢新會1,2,3，張翀1,2,3

1 清華大學 化學工程系 生物化工研究所，北京 100084 2 工業生物催化教育部重點實驗室，北京 100084 3 清華大學 合成與系統生物學中心，北京 100084

微生物培養是微生物學的起源和根本，成功的微生物培養是進行后續研究的重要前提與基礎。但是，微生物培養操作不僅耗費了科研人員大量的精力和時間，還存在著極大的人為誤差。近年來，容量小、高通量、模塊化、可操作性良好并可進行在線檢測的微生物微培養系統得到了微生物學領域的廣泛關注。文中介紹了應用于微生物學領域的微培養系統，并按系統構成分類討論了微生物微培養系統的發展、應用和展望。

微培養系統，微生物培養，自動化培養系統，模塊化培養系統，微流控系統

微生物培養作為微生物學的根源，卻是一個極少被關注的領域[1]。法國化學家Pasteur被認為是最早可重復培養微生物的科學家，他使用以灰燼、糖和銨鹽為配方的培養基，成功實現了微生物的穩定培養[2]。Koch在Pasteur所研發的培養基配方的基礎上進行了改良，在培養基中加入了牛肉提取物或牛血清，使微生物能夠更好地生長[3]。上述液體培養技術的開發原本是為了培養純培養物，但是，使用液體培養基進行連續稀釋純化微生物的難度較高且操作效率極低，這個問題促使Koch開發出了能夠分離出單克隆的固體培養基[4]。固體培養技術作為最初實現平行培養的技術，至今仍是微生物學，尤其是臨床微生物學中的黃金標準。

雖然傳統的批量培養系統因廉價、可操作性高等優點而被廣泛使用，但是隨著微生物的生長，培養基中的化學成分將會發生變化，從而導致系統噪音的產生，影響結果判斷。為此，Monod、Novick和Szilard提出了能夠減少系統噪音的連續培養系統用于追蹤微生物的生長和進化 (圖1)[5-7]。通過連續換液，培養器中的養分得以維持穩定，進而保證了微生物的持續生長。同時，由于連續培養器中都帶有控制器件，可實現操作的自動化?，F有的微生物連續培養系統主要分為恒化器 (Chemostat) 和恒濁器 (Turbidostat) 兩大類。前者采用開環控制器，后者采用閉環控制器進行系統控制，用以穩定微生物培養條件。

近年來，微生物反應器的微型化和平行化逐漸得到研究者的關注。微型生物反應器作為一種可長時間以少量試劑運行的系統，通過引入各種分析技術實現了多參數的精密檢測和控制，同時通過操作自動化，減少了實驗中人為操作失誤和產生的誤差。此外，借助多參數精密調控和平行化操作能力，可以同時進行多項實驗，大幅提高了實驗效率。在特定條件下，培養體系還能夠實現單細胞培養，用以研究微生物群中一些容易被忽視的個體。因此，微生物微培養系統和技術逐漸成為實驗室微生物培養的應用趨勢。

圖1 恒化器的設計圖

1 微連續培養系統

微連續培養系統是一種可用于微生物自動連續培養的毫升級微生物培養系統。圖2為微連續培養系統的概念圖，系統主要由光學器件、控制器件、無菌導管、磁力攪拌器以及一些附加元件如毫流控 (Millifluidics)、溫控裝置等組成。該系統將菌液置于無菌導管中，培養至一定條件后，可根據傳感器所輸出的調節信號，按設備設計以及實驗需求，加入培養液或其他試劑。培養過程中，通過不間斷的磁力攪拌，舊的培養液與新的培養液均勻混合，并使得氧氣能夠更有效地溶入培養液中，維持微生物的生長。當內部體積達到一定水平后，培養液將因器皿內外的壓力差而被排出，實現連續培養系統的換液功能。這一系統所使用的器件多為容易入手或可借助3D打印技術等簡單的加工方法制造的器件，相較于其他大型設備，該設備制造成本低，占用空間小，并且可使用一個控制器件同時監測多個管道，實現高通量的微生物培養與分析。這些優勢使恒濁器及其衍生儀器得以在實驗室中普及。

圖2 毫升級連續培養系統的設計圖

2011年，Toprak等改良了傳統恒濁器的設計，并使用微連續培養系統進行了微生物微容量培養[8-9]。Toprak等使用這套系統進行了微生物的抗藥性研究，并在過程中證明了該套裝置可實現微生物的長期自動化培養[8]。

Takahashi等設計的微型恒濁器是第一臺開源性微型恒濁器[10-11]。借助3D打印技術和模塊化零件的使用，這套系統的制造成本低于2000美元。這套系統的另一個特點在于能夠同時在線檢測微生物的濃度和表達量。其通過切換導管上所安裝的650 nm和470 nm激發光源以及選擇適當的濾光片，成功地實現了恒濁器濁度和熒光的在線檢測。此后雖然也有其他的相關嘗試[12-13]，但是3D打印技術難以實現高精度加工，導致這些開源性微型恒濁器的運行誤差較大，降低了實驗的可重復性。該問題通過將硅膠管道換成聚四氟乙烯管道，并通過加濕加壓的方法得到了改善[14]。2018年，Wong等發明了使用模塊化零件組成的連續培養儀eVOLVER[15]。相較于其他的微連續培養器，該儀器內置了溫控裝置，可為每個培養器分別加熱，排除了將裝置置于恒溫培養箱中保溫而導致的加熱不均勻所造成的誤差，也可實現在溫度調控上的多樣性實驗。此外，eVOLVER中的流體操作皆通過毫流控管路調控，從另一角度解決了由硅膠管所帶來的進樣精度問題。

2 微流控微培養系統

隨著精密儀器和光電技術的發展，科學家們于20世紀末發明了微全分析系統 (μTAS)[16-17]。這套系統使人們能夠更好地于微觀和介觀尺度上操控流體，進而實現微容量反應。這項技術促進了可操控單細胞的皮升級微生物微培養裝置如芯片上培養平皿[18]、真菌生物薄膜動力學在線檢測芯片[19]、單細胞操控裝置[20]和皮升級培養槽[21]的開發。這些皮升水平的裝置尺寸一般小于毫米，可用于操作微生物單細胞，并觀測單細胞的生長，是微生物培養領域的劃時代工作。通過不斷地導入培養液和透過培養槽壁上的縫隙排出多余的微生物細胞[22]，皮升級培養槽能夠實現恒濁器中的開環控制器功能，成功將恒濁器微化至皮升水平。圖3為微流控微培養系統的概念圖，其中，圖3A為單相微流控微培養系統，圖3B為液滴微流控微培養系統。

2.1 單相微流控中的微容量培養

雖然連續培養在微生物培養中擁有一定的優勢，但是在營養過剩的培養體系中容易形成生物薄膜[23]。在微培養器中，由于尺度效應，這個現象將會更加嚴重[24]。生物薄膜的形成，不僅容易干擾連續培養器的運行[25]，還將在進行稀釋后成為占據培養液空間的主要微生物，影響分析結果。2005年，Balagaddé等使用微流控技術，成功地在微尺度上制造恒化器，實現了長時間微生物培養，并通過閥的調控，實現了對黏附在通道壁上的微生物薄膜的清除和菌液的稀釋[26-27](圖3A)。該芯片可置于顯微鏡下進行單細胞水平的觀察和分析，這一功能的實現意味著所取得的數據將從平均信號轉向統計信號。這一進步讓我們能夠觀測如標準偏差等除了平均數據以外的、傳統的實驗條件下所無法觀測的信號。但是，這套微流控系統中使用了較為復雜的能動裝置，如微蠕動泵。雖然這樣的零件容易被嵌入微流控芯片中，提高流體的可操作性，但也同時提高了系統的復雜程度和損壞概率。該體系中培養的微生物密度可達每毫升2×109個大腸桿菌細胞，與搖瓶培養所得結果接近。

得益于尺寸效應，基于微流控技術的微培養器中具備傳質性能方面的優勢，例如Lee等所開發的容量為1 mL的微流控恒化器和恒濁器中的氧傳遞率可達到kLa≈0.025 s–1，混合2 s即可達到完全混合狀態。此外，該系統能夠將流體控制精度調整到18 nL，且對溫度、細胞密度、溶氧和pH都能夠以閉環控制的方式達到精確調控；通過對閥和泵的調控，可在單個裝置內同時實現批量培養、恒化器或者恒濁器的功能[22]。但是，單相流體因運輸液與反應液相同，容易出現污染現象[28]。如Lee等的裝置對無菌條件的維持只能達到3周[22]，難以實現一般微生物進化等實驗中所要求的長達數月的連續培養。同時，單相流體意味著培養液中的養分為所有微生物共享而非獨立，這仍然無法解決關于生長緩慢的微生物的培養問題。此外，單相微流控系統中流體流動所產生的剪切力對培養中的微生物也會造成影響。

圖3 微流控微培養系統

2.2 微液滴培養

微生物微液滴培養技術的起源可追溯至1950年，Lwoff使用液滴培養巨大芽孢桿菌，并對其溶源性進行了相關研究。得益于液滴內微生物操作的簡便性，即易于觀察、運輸和換液，Lwoff成功實現了在顯微鏡下觀察噬菌體對微生物所產生的影響，同時也證明了在不含噬菌體的液滴中的微生物的可培養性[29-30]。相較于搖瓶等宏觀體系，作為擁有大范圍自由表面的流體，微液滴體系的大比表面積利于氣體交換，提高了培養效率。同時，作為獨立生物反應器的微液滴，也使生長緩慢的微生物的富集和高通量分析成為可能。此外，一般情況下，大分子難以穿透液滴界面，避免了樣品污染和生物薄膜形成的問題。

Weaver是近代首先在臨床微生物學中使用液滴體系的科學家。Weaver等將微生物按一定比例混入海藻酸鈉溶液中，使用振動開口將液流切斷形成液滴，滴入氯化鈣溶液中固化成微球。其中，海藻酸鈉溶液中加入了pH響應熒光顯色劑。微生物代謝過程中所生成的二氧化碳可提高液滴內的酸性程度，使顯色劑變色，在熒光顯微鏡下觀察就能判斷液滴內微生物的生長情況。液滴體系的優勢使含微生物液滴足以在一個分裂周期內就能夠被觀察到明顯的變色，從而使這套系統成為了一套高效的微生物檢測系統[31-32]。由于該裝置的液滴生成機制與流式細胞儀相近，液滴中的微生物包覆率也如同流式細胞儀，可使用泊松分布進行預測[33]。根據泊松分布的定義[34-36]，影響微生物包覆率的關鍵參數為單位容量中微生物濃度和單位容量可生成的液滴數的比例。這意味著在能夠得知液滴平均容量的情況下，只有微生物濃度會對包覆率造成較大的影響。換言之，在微生物分布均勻的前提條件下，其他因素如液滴大小等，并不會影響微生物的包覆率。

雖然批量乳化液滴生成效率高，但是卻無法進行液滴后期操作，限制了液滴體系的應用。2001年，Thorsen等首次在微流道內生成了粒徑均一的液滴[37]，從此翻開了液滴微流控技術的歷史篇章。液滴微流控技術不只給批量乳化所帶來的粒徑分布較大的問題提供了解決方案，也促進了液滴后期操作技術的發展，如皮升注入[38-39]、熒光激活液滴分選 (Fluorescence-activated droplet sorting)[40]、結合[41]、切割[42]等技術，實現了液滴內多步反應，使液滴體系成為一種更為穩定的操作體系。

Grodrian等提出了使用液滴微流控高通量培養微生物的方法，并證明了在特氟龍管道內60 nL培養液中的大腸桿菌和熒光假單胞桿菌的可培養性，其培養密度可達到每個液滴106細胞[43]。Dewan等在芯片中生成包裹普通小球藻的液滴，并通過33 d的保存，觀察了普通小球藻于液滴中的分裂與生長，以及各階段的產脂肪酸效率，并推算出了普通小球藻的生長動力學[44]。Ito等開發了一種可連續換液的開放微液滴反應器，實現了微液滴恒化器的功能[45]。如今，液滴微流控微培養系統能夠實現在線單細胞包覆、培養、換液、分析等功能[46-47]，已是一項相對成熟的技術 (圖3B)。

近年，清華大學成功將微生物微液滴培養技術裝備化，開發了一套名為全自動高通量微生物液滴培養儀 (Microbial microdroplet culture (MMC) system) 的裝置 (圖4)。該系統使用微流控芯片進行微生物培養液滴生成和換液，液滴體積2 μL，可同時并行對200個獨立的微生物液滴進行培養和連續傳代。特別的，由于在油包水微小體系內液滴內溶氧和混合水平良好，其中的微生物生長性能接近或優于搖瓶。此外，基于芯片系統的模塊化優勢，MMC系統還可滿足多樣的實驗需求，例如培養物熒光、可見光、溶氧和pH在線檢測、微生物菌落計數、高通量篩選、適應性進化等不同功能，顯示出較大的應用潛力。

3 應用

如前節所描述，微生物微型生物反應器在微生物學的研究上有著極其廣泛的應用。本節旨在介紹微生物微型生物反應器在微生物學研究上的應用。

3.1 微生物耐藥性和進化研究

微生物在獲得了對某種藥物的抗性之后，選擇壓力將會被減輕[22]，這時需要向培養基內添加化學因子，以維持選擇壓力，而這項需求使微生物抗藥性研究成為一項極具挑戰性的工作。Toprak等開發的微型生物反應器Morbidostat，是一種能夠維持選擇壓力的裝置。在該培養器中，系統在所設定的時間點上通過光學傳感器對微生物進行濃度檢測。當微生物的濃度達到預設濃度，同時生長速度大于0時，系統將通過調控向導管中加入含化學因子的培養液，對微生物施加選擇壓力。此后，在預設的時間內，當導管中的微生物濃度同時滿足上述兩個條件時，系統將會繼續向導管內添加含化學因子的培養液，維持微環境中的選擇壓力；而在任意一個條件未被滿足的情況下，系統則只向培養器內添加培養液，以復蘇微生物。Toprak等使用這套系統研究了大腸桿菌的去氧羥四環素、氯霉素和甲氧芐啶抗性的形成過程，發現了甲氧芐啶抗性形成過程中的階段性適應現象，并揭示了微生物達到高抗藥性的有序適應途徑[8]。Baraban等則在液滴中分析了頭孢噻肟對模式菌株大腸桿菌MC4100-YFP的最小抑菌濃度[46]。他們所開發的設備操控精度高，可調配濃度變化為3.562 5×10–5μg/mL的精細濃度梯度變化，為一般孔板的133倍以上，為微生物耐藥性分析帶來了一套高效的研究設備。

圖4 全自動高通量微生物液滴培養儀

3.2 微生物高通量分析分選

在微生物微型生物反應器中，可通過取樣至微孔板進行熒光檢測或在線檢測的方式實現高通量檢測。雖然這種檢測方式的通量較傳統檢測方式有所提高，但是一些微弱的信號容易被忽視, 難以實現單細胞水平的分析。借助熒光激活細胞分選技術和熒光激活液滴分選技術，微生物微型生物反應系統能夠實現微生物的高通量分選。

Agresti等使用液滴微流控技術進行菌庫分析，分選出了較母株所產辣根過氧化物酶活性高10倍的釀酒酵母[48]。Staffan等使用熒光激活液滴分選技術，對產α淀粉酶的釀酒酵母進行分選，成功地從菌庫中篩選出了高α淀粉酶產量的釀酒酵母[49-50]。Beneyton等則成功地使用熒光激活液滴分選技術分選出了高α淀粉酶產量的黑曲霉[51]。他們也用這套技術培養并分選了產β-1,4-內切木聚糖酶B和C、1,4-β-纖維二糖水解酶A、葡聚糖內切酶A和天冬氨酸蛋白酶的解脂耶氏酵母[52]。Kim等則使用液滴微流控分選出了高生長速度和高產油率的萊氏衣藻[53]。

通過在液滴中共培養生物傳感器和微生物細胞工廠，Siedler等成功地使用微生物生物傳感器感知胞外產物的產量，并將高產量菌株選出，突破了傳統代謝工程的瓶頸[54]。在Siedler的實驗中，我們還可以設想將生產菌株在液滴中單獨培養，而傳感器在液滴或搖瓶中培養后，再通過皮升注射的方式注入含生產菌株的液滴內進行檢測，這套技術便可實現使用培養條件不同的菌株分別作為生產菌株和傳感器了。

這些高通量分選技術也被進一步應用于未知微生物的生物資源勘探 (Bioprospecting)，例如Najah等開發了β-D-纖維二糖苷-6,8-二氟-7-羥基香豆素-4-甲磺酸鹽[55]，并將其作為熒光底物，利用Griffiths課題組開發的熒光激活液滴分選芯片[40]，成功地從土壤樣本中篩得產纖維素酶微生物[56]。

隨著吸光度激活液滴分選 (Absorbance- activateddropletsorting) 技術[57]和拉曼激活液滴分選 (Raman-activateddropletsorting)[58]等新技術的開發和普及，我們將能夠識別更多自然界中所存在的未知分子和產出這些分子的菌株。

3.3 微生物富集

通過加入合適的化學因子，微連續培養系統可用于培養能夠適應某種選擇壓力的微生物。在換液和添加化學因子的過程中，只有適應環境壓力的微生物能夠存活、生長和增殖，這些擁有特定特征的微生物因此能夠被富集。例如，Toprak等富集了對所使用的藥物有抗性的微生物[8]。

但是，微連續培養系統無法富集生長緩慢的微生物，這是由于在共同的生長環境中，生長較快的微生物將會在養分競爭中優越于生長緩慢的微生物，并完全取代這些微生物。而能夠包覆并培養單細胞的微液滴技術則能夠富集這些生長較為緩慢的微生物。Bachmann等于2013年使用液滴富集成長緩慢但卻擁有較高代謝效率的乳酸菌突變體的研究成果[59]推動了液滴微生物學的進步，并使液滴微生物學受到了微生物學領域的廣泛關注。

此外，在富集和探索未被培養的微生物的過程中，微液滴技術也有著重要的應用。Akselband等使用攪拌乳化技術將已被熒光染色的海洋微生物包入凝膠液滴中，再使用流式細胞儀對液滴進行分選，選出包裹著海洋微生物的液滴，并在這些含微生物的液滴中成功地培養和富集了生長緩慢的海洋微生物APP462[60]。

3.4 未知微生物的探索

世界上可培養的微生物只占據了微生物總數的1%[61-64]。絕大部分微生物的不可培養性限制了我們對微生物表型的認知，導致我們難以理解自然界中的許多現象，并因此錯失了許多自然界中的資源。這些微生物不能被培養的原因主要有兩個：第一，這些微生物的特性未被解明，所需要的養分未知；第二，實驗室中所使用的培養基的養分比自然環境中多數倍至數百倍，雖然能夠使微生物快速生長，但同時也抹殺了成長緩慢的微生物。Zobell研發的海水肉湯marine agar 2216[65]中所含的有機成分就比自然海水中多170倍。雖然使用生長環境的樣本也能夠培養這類微生 物[66-67]，但是如果這類微生物與其他微生物、生物或非生物之間存在共生關系，那么這類微生物也無法生存。Kaeberlein等開發了一種名為滲透捕抓器的工具 (圖5)，證明了難培養微生物與原環境間存在共生關系[68]；D’Onofrio等發現從彭德森湖濱州立公園中分離的一種黃海芽孢桿菌在缺少環境中存在的一種巨大芽孢桿菌所分泌的成長因子時便無法生長[69]。因此，實現高通量共培養和在線檢測將有利于未知微生物的探索。

圖5 滲透捕抓器的組成部分

最近十年，研究人員逐漸意識到了未知微生物的重要性，繼而開發了各類難培養微生物的培養工具。滲透捕抓器被成功地用于富集多樣的環境微生物樣本[68,70]。Nichols等開發了一種微型化的滲透捕抓器，名為分離芯片 (Isolation chip, ichip) 的高通量原位培養工具[71]。該芯片有384 (2 192) 個直徑為1 mm的穿透微孔。將含微生物瓊脂糖注入孔中后，固化成固體培養基。芯片兩面貼上0.03 μm濾膜，另外以兩片芯片將含固體培養基芯片夾起，鍵合即形成分離芯片。將分離芯片置于原位環境或原位環境樣本中，可高通量培養難培養微生物。相較于滲透捕抓器，微型化讓滲透芯片實現了更高通量的未知微生物培養。但是，該方法仍然依賴于原位環境培養法，無法為難培養微生物的人工培養提出有效的解決方案。

雖然無法通過單細胞共同培養的方式優化培養條件以及從混合環境樣本中鎖定微生物，但是微型連續培養系統可以通過長時間連續共培養和監測的方式，在低養分培養基中人工培養至今未被成功培養的微生物。Park等通過微液滴中微生物的共培養，不僅證明了微液滴內能夠實現相互依賴的微生物的共培養[72]，還成功地培養了海鞘中的菌群，并證明了使用海水胰蛋白胨大豆肉湯所培養的菌群雖然生長較為緩慢，但是富有多 樣性[73]。

4 結論與展望

自Louis Pasteur成功地在實驗室中培養微生物以來，至今已過了160年，但是從實驗室中可培養的微生物占比和科研人員在微生物培養中所耗費的時間可得知，微生物培養技術進步甚微。其主要原因在于傳統的批量和連續培養體系的容量大，難以對培養環境進行精密調控，且培養成本高，難以實現平行化和高通量培養。微生物微培養體系則能為上述問題提供重要的解決方案。結合微生物培養技術發展史，以及目前工程技術發展趨勢和微生物培養中的需求，我們認為未來微生物微培養系統的重要發展趨勢將包括：

1) 全流程自動化。生物實驗的低可重復性已經是一個不爭的事實[74]。微生物培養系統通過與物聯網 (Internet of Things, IoT) 技術結合，將組成微生物實驗操作儀器網絡中的重要一環，實現無人干預的實驗操作，降低由人為失誤所帶來的不可重復性。例如，將清華大學所開發的常壓室溫等離子體 (Atmospheric room temperature plasma, ARTP) 誘變育種儀[75]和MMC等進行整合即可實現誘變、復蘇、初步富集、單細胞連續培養、菌落操作、結果分析的智能調控全自動操作過程。

2) 數據化。在微生物學研究中，微生物的基因型-表型關聯 (Genotype-phenotype association, GPA) 一直是一項重要的課題[76]。憑借先進的測序技術雖然可以測得許多基因數據，但是直至今日，表型數據的獲取仍然遠遠滯后于基因型數據。利用微培養系統的可追蹤性和可監測性將會為基因型-表型關聯研究提供有效工具。具體而言，高通量地追蹤培養系統里的微生物，并對它們進行在線檢測，將使我們能夠獲得大量與微生物培養性能相關的表型數據，從而為深入研究微生物表型與基因型的關聯提供數據基礎。

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Micro-cultivation system in microbiology: frontiers and prospects

Zhenglin Tan1,2, Chunxuan Ma1,2, Xinhui Xing1,2,3, and Chong Zhang1,2,3

1 Institute of Biochemical Engineering, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China 2 Key Laboratory for Industrial Biocatalysis of the Ministry of Education, Beijing 100084, China 3 Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Microbial cells cultivation is not only the origin, but also the foundation of microbiology. Researches in microbiology can only be carried out when the microbial cells can be cultured. However, conventional microbial cell cultivation is not only time consuming and labour intensive, but human error is also inevitable. Recent years, automated, modularised microbial cells micro-cultivation systems with small volume, good controllability, and equipped with real-time monitoring system have attracted great attention in microbiology. This review presents the state-of-the-art micro-cultivation systems which are implemented in microbial cells cultivation. The key development, applications of various system classified based on their construction, and the prospects of micro-cultivation system are discussed and insights into them are also provided.

micro-cultivation system, microbial cells cultivation, automated cultivation system, modularised cultivation system, microfluidic systems

March 13, 2019;

May 14, 2019

National Key Scientific Instrument and Equipment Project of The National Natural Science Foundation of China (No. 21627812), National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFF0202303), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (No. 20161080108).

Chong Zhang. Tel: +86-10-62772249; Fax: +86-10-62787472; E-mail: chongzhang@tsinghua.edu.cn

國家重大科學儀器設備開發專項 (No. 21627812)，“十三五”國家重點研發計劃 (No. 2016YFF0202303)，清華大學自主科研項目 (No. 20161080108) 資助。

陳政霖, 馬春玄, 邢新會, 等. 微生物微培養系統研究現狀與展望. 生物工程學報, 2019, 35(7): 1151–1161.

Tan ZL, Ma CX, Xing XH, et al. Micro-cultivation system in microbiology: frontiers and prospects. Chin J Biotech, 2019, 5(7): 1151–1161.

(本文責編 陳宏宇)