2013-2018年北京市志賀菌藥物敏感性狀況研究

呂冰 田祎 張新 黃瑛 王全意 曲梅

細菌性痢疾是由志賀菌屬病原菌感染引起的一種常見腸道傳染病，志賀菌對人群普遍易感，嚴重影響人類健康。在發展中國家，菌痢是五歲以下兒童死亡的重要原因之一[1]。2005年8月，衛生部發布《全國細菌性痢疾監測方案(試行)》，依據該方案，北京市將志賀菌監測納入常規監測范疇。十余年的監測結果顯示，宋內志賀菌已經成為北京市痢疾病原菌的優勢菌株[2]，并且其耐藥率一直處于較高水平[3]。本研究收集了2013-2018年痢疾監測工作中分離到的志賀菌，進行藥物敏感性試驗，確定是否為產超廣譜β內酰胺酶(extended spectrum β-lactamases，ESBLs) 菌株，并且對ESBLs菌株進行PCR擴增，檢測其耐藥相關基因位點，了解北京市近2013-2018年志賀菌藥物敏感性流行情況。

1 材料與方法

1.1菌株來源 根據《國家霍亂痢疾監測方案北京實施辦法》以及《北京市痢疾及其它感染性腹瀉監測與疫情處置工作方案》，北京市16區均為監測點，每個監測點選取1～2家有一定工作基礎的醫院作為監測醫院腸道門診，每年4-10月每月完成40份病人糞便樣本的檢測，其他月份完成10～20份糞便標本的檢測，并上送分離到的病原菌，由各區疾控中心進行鑒定，菌株鑒定標準依據依據國家診斷標準《細菌性和阿米巴性痢疾診斷標準WS287-2008 附錄A》，鑒定血清為日本生研志賀菌鑒定血清。

1.2藥物敏感性試驗 藥敏試驗根據美國臨床與實驗室標準委員會(Clinical and Laborary Standards Institute, CLSI)推薦的最小抑菌濃度法(minimal inhibitory concentration, MIC)。藥敏試驗應用上海星佰生物技術有限公司提供的革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板，應用的藥物有：環丙沙星、氨芐西林、氯霉素、磺胺異惡唑、復方新諾明、萘啶酸、阿莫西林-克拉維甲酸、頭孢曲松、慶大霉素、四環素、頭孢西丁、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南、頭孢噻肟-克拉維酸、頭孢他啶-克拉維酸。其結果與CLSI推薦的《抗菌藥物敏感性試驗執行標準：第26版》比較，以大腸埃希菌ATCC25922作為質控菌株。

1.3產ESBLs菌株的表型確證實驗 參照CLSI推薦的頭孢噻肟、頭孢噻肟-克拉維酸、頭孢他啶、頭孢他啶-克拉維酸MIC法的確證實驗鑒定產ESBLs的志賀菌。與克拉維酸聯合的藥物MIC相對單獨藥物的MIC減低≥3個倍比稀釋度，即確定為產ESBLs菌株。

1.4產ESBLs相關基因位點檢測及基因型分析 采用裂解法提取志賀菌DNA作為模板，參照文獻合成TEM型、SHV型、OXA型、CTXM型的ESBLs編碼基因特異性引物，引物序列見表1,引物序列來自于參考文獻[4-6]。PCR反應體系為25 μL，包括雙蒸水9 μL、2×緩沖液12.5 μL、10 μmol/L引物各0.5 μL、DNA模板2 μL。PCR反應試劑均購自北京擎科新業生物有限公司，由北京擎科新業生物技術有限公司完成PCR產物的測序，測序結果在NCBI提供的數據庫中比對。

1.5統計學方法 應用SPSS 20.0分析菌株耐藥結果以及耐藥相關基因攜帶率等。

表1 產超廣譜β-內酰胺酶相關基因引物合成序列

2 結果

2.1菌株血清分型鑒定結果 2013-2018年，共收集266株志賀菌，其中,2013年72株，2014年96株，2015年66株，2016年24株，2017年6株，2018年2株。266株志賀菌中宋內志賀菌207株，占77.8%,福氏志賀菌56株，占21.05%，鮑氏志賀菌1株(鮑氏4型),痢疾志賀菌2株(痢疾志賀菌2型和9型)。所有宋內菌中宋內I型181株，宋內II型26株。福氏志賀菌株的分型情況如下：F1a 6株，F2a 36株，F1b 1株，F2b 4株，F4 2株，F4c 2株，Fx 1株，Fx變種2株，Fy 1株，Fy變種1株。

2.2藥物敏感性檢測結果 志賀菌對氨芐西林、復方新諾明和萘啶酸三種藥物的耐藥率已經超過90%，頭孢類藥物如頭孢西丁、頭孢吡肟、頭孢他啶以及環丙沙星的耐藥率低于20%，266株志賀菌全部敏感的藥物為亞胺培南。福氏志賀菌對環丙沙星、氯霉素和阿莫西林-克拉維甲酸的耐藥率較宋內志賀菌高，宋內志賀菌對磺胺異惡唑、復方新諾明和慶大霉素的耐藥率較福氏志賀菌高 (表2)。

2.3產ESBLs菌株確證實驗 按照CLSI推薦的頭孢噻肟、頭孢噻肟-克拉維酸、頭孢他啶、頭孢他啶-克拉維酸MIC法的確證實驗，266株志賀菌中，95株志賀菌確證為產ESBL菌株。其中,19株為福氏志賀菌，76株為宋內志賀菌。

2.4耐藥相關基因檢測 通過PCR方法檢測耐藥相關基因，結果顯示：95株21株檢出TEM基因(22.1%，21/95)，18株檢出OXA基因(18.95%，18/95)，75株檢出CTXM基因(78.95%，75/95)；75株CTXM陽性PCR產物經序列比對發現有1株CTXM3型；21株CTXM14型；53株CTXM15型。分析三種耐藥基因2013-2018年在產ESBLs菌株中的攜帶率，發現CTXM基因攜帶率一直處于較高水平，除2017年外，OXA和TEM基因的攜帶率一直較低(圖1)。

圖1 北京市2013-2018年產ESBLs志賀菌的三種耐藥相關基因攜帶率

3 討論

3.12008年以后，宋內志賀菌已取代福氏志賀菌成為北京地區優勢菌型[2]。監測表明，2013-2018年宋內志賀菌株依然是北京市優勢菌株，并且志賀菌的耐藥情況日益突出。北京市志賀菌對氨芐西林、復方新諾明和萘啶酸三種藥物的耐藥率較高，臨床常用的頭孢曲松和頭孢噻肟的耐藥率也達到了40%以上，這個結果應與臨床上常用這兩種藥物有關，其他學者也得到了相近的研究結果[7]。志賀菌對頭孢西丁、頭孢吡肟、頭孢他啶以及環丙沙星藥物的耐藥率比較低，可考慮用于臨床，但環丙沙星對于福氏志賀菌耐藥率較高，臨床應用中應予以關注。

表2 2013-2018年 北京市266株志賀菌藥物敏感性檢測結果

注：*為Fisher概率法計算得出的P值。

3.2研究結果顯示，266株志賀菌產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)確證試驗，有95株志賀菌為產ESBLs菌株。ESBLs指能分解青霉素類、頭孢菌素類及氨曲南等β-內酰胺類抗生素的酶，其能夠使細菌對這類藥物產生耐藥性而導致治療失敗[8,9]，因此，明確細菌是否產生ESBLs具有重要的臨床意義。對ESBLs特異相關基因的測序結果顯示，北京地區產ESBLs宋內志賀氏菌以攜帶CTXM基因為主，主要為CTXM15型，其次為TEM型。以往的研究中，鮑春梅等[10]也得出相似結論，認為北京市產ESBLs志賀菌株以CTXM型為主；浙江省和安徽省也報道檢出CTXM15型和CTXM14型ESBLs[11,12]。本研究發現CTXM基因2017年攜帶率出現降低，可能是由于該年份菌株量過少引起的異常結果。CTXM基因多由可接合的質粒攜帶，更易于通過質粒的水平轉移方式傳播，所以對CTXM型ESBLS菌株的長期監測具有很高的公共衛生學意義，需要在日常工作中持續開展。