吡啶查爾酮類化合物對小鼠肝纖維化的作用

金 凡，朱盼虎，李家明,2，黃元政，劉萬冬

(安徽中醫藥大學1.藥學院、2.安徽省中醫藥科學院藥物化學研究所,安徽 合肥 230038)

脂聯素是脂肪組織分泌的一種脂肪細胞因子[1]，為脂聯素受體內源性激動劑，可通過結合AdipoR1和AdipoR2，經腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)途徑來調節細胞能量利用[2]。研究發現，脂聯素可以限制活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的增殖和遷移，具有強烈的抗肝纖維化活性[3]。HSC的活化是肝纖維化疾病形成的重要環節，高糖高脂狀態對四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化有促進作用[4]。若可以有效抑制HSC的活化增殖，便能在一定程度上改善肝纖維化狀況。CCl4誘導肝纖維化的機制是引起實質炎癥和肝細胞壞死，同時產生相關細胞因子，促進HSC的增殖活化等。

有研究報道，天然有機化合物查爾酮類在體外可抑制HSC-T6細胞膠原的合成[5]。AdipoRon為Okada-Iwabu等[6]報道的首個小分子脂聯素受體激動劑，課題組前期根據AdipoRon合成了一系列能夠改善小鼠肝纖維化的查爾酮化合物。在此基礎上，進一步合成兩個新的吡啶查爾酮類化合物H7和H8(Fig 1)，研究其對小鼠肝纖維化的作用。

Fig 1 Structure of H7 and H8

1 材料與方法

1.1 材料HSC-T6細胞，購自南京凱基生物科技發展有限公司；Balb/c ♂小鼠50只，(18～22) g，購自南京大學模式動物研究所，實驗動物許可證號：SYXY(蘇)2016-0012。化合物AdipoRon、H7和H8，由本實驗室合成。

Tab 1 Effects of H7 and H8 on liver index，serum AST and ALT in liver fibrosis mice

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

1.2 方法

1.2.1實驗分組 Balb/c小鼠分為5組，每組10只，即正常組、模型組、H7化合物100 mg·kg-1組、H8化合物100 mg·kg-1組、吡非尼酮(Pirfenidone)250 mg·kg-1陽性對照組。正常組與模型組灌胃給予相應溶劑，其余3組灌胃給予相應藥物。

1.2.2CCl4肝纖維化模型的制備和給藥方法 除空白組外，其余各組動物分別以CCl4腹腔注射造模(CCl4以1 ∶4比例溶解于橄欖油中，0.5 mL·kg-1)，正常組注射相應的橄欖油溶劑，每周腹腔注射2次，共造模6周。從造模第3周開始各組灌胃給藥，空白組給予相應溶劑，每天1次，共給藥4周。末次給藥后48 h，分別眼眶取血，離心，分離血清，備用。隨后迅速剖取肝臟，觀察肝臟形態情況，稱重，計算肝指數。

1.2.3指標檢測 肝指數：臟器指數/%=臟器質量/體質量×100%；肝功能：血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)含量。

1.2.4MTT法檢測H7和H8對HSC-T6細胞增殖的抑制作用 取對數生長期的HSC-T6細胞，1×104·L-1接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2條件下培養，加含10%胎牛血清的DMEM培養液孵育24 h，待細胞貼壁后，加入不同濃度的待測化合物溶液(200、100、50、25、12.5、6.25 μmol·L-1)，每個濃度3復孔，陰性組加等體積溶媒，置于CO2恒溫培養箱中培養48 h后，加入MTT溶液4 h后，吸去培養液，加入150 μL DMSO，振蕩5 min，酶標儀在570 nm處測吸光度值(A)，進行IC50檢測。

2 結果

2.1 H7和H8對肝纖維化小鼠轉氨酶的影響如Tab 1所示，與正常組比較，模型組小鼠肝指數以及血清中AST和ALT含量明顯升高(P<0.01)，表明肝損傷模型成功建立。給予H7和H8化合物治療后，小鼠肝指數、血清中AST和ALT較模型組明顯降低(P<0.05，P<0.01)，與吡非尼酮作用相當，提示H7和H8可抑制AST和ALT的活性。

2.2 H7和H8對HSC-T6細胞增殖的抑制作用由所測得的H7、H8和AdipoRon的IC50值可知，與陽性對照AdipoRon相比，化合物H7和H8對HSC-T6細胞增殖具有明顯的抑制作用。H7、H8、AdipoRon的IC50分別為5.627、4.801、32.447 μmol·L-1，提示H7和H8在一定程度上能改善肝纖維化狀況。

3 討論

本研究通過制備CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型，發現H7和H8可以降低肝纖維化小鼠模型肝指數，以及血清中AST和ALT含量。同時，通過對HSC-T6細胞增殖活性的檢測，結果表明H7和H8對HSC-T6細胞增殖具有一定的抑制作用，并且活性優于AdipoRon。提示化合物H7和H8可能具有一定的抑制肝纖維化活性，但化合物是否具有良好的改善CCl4誘導的小鼠肝纖維化作用，有待進一步機制研究。