酸敏感離子通道-1a在急性肺損傷大鼠肺組織中的表達及作用初探

孫禮賓，朱月琴，潘學勝，王亞男，陳瑩瑛，陳 運，劉敬浩，葉 瑩，胡成穆，黃 艷

(1. 安徽醫科大學附屬巢湖醫院兒科，安徽 合肥 238000; 2. 安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥 230032; 3. 安徽醫科大學校醫院，安徽 合肥 230032)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由膿毒血癥、創傷、休克等心源性以外的各種肺內、外因素所致的急性缺氧性呼吸衰竭，主要表現是難治性低氧血癥和呼吸窘迫，若不能及時控制病情，將進一步發展為更嚴重的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[1]。其以肺容積減少、肺順應性降低、通氣/血流比例失調為病理生理特征，肺部影像學上表現為非均一性的滲出性病變[2-3]。該病起病急驟，病情發展迅速，預后極差，致死率高達30%以上[4]。自1967年，Ware等[5]首次報道肺損傷以來，關于ALI的研究層出不窮，并且取得了較大的進展，但患病率和致死率仍居高不下。因此，關于ALI的發病機制及臨床治療的研究，是臨床危重病學領域備受關注的焦點和重要的研究方向。

酸敏感離子通道(acid sensitive ion channels，ASICs)是一類陽離子通道蛋白復合體，為上皮鈉通道(epithelial sodium channel, ENaC)超家族的一員。有研究顯示，能否有效清除肺泡中過多的液體是治療ALI的關鍵，而ENaC在肺水腫液的清除中扮演重要角色[6-8]。ASICs作為ENaC家族的一員，在炎癥(關節炎)、缺血、腫瘤等伴有組織酸化的疾病中，也發揮著重要的病理生理作用[9]。ALI的前期階段即伴肺臟炎癥，局部的炎癥反應可導致局部組織酸化。其是否誘導肺內ASICs表達及活性變化，此變化在ALI中是否發揮作用？目前國內外無相關研究。ASIC1a是ASICs亞基中能通透Ca2+的主要亞基，當胞外pH下降時可被激活[10]。阿米洛利可以阻斷ENaC Na+/H+交換體和Na+/Ca2+交換體，是ASICs的非特異性阻斷劑[11]。課題組前期研究發現，在脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導的ALI大鼠肺組織中，ASIC1a的表達明顯上調，可能與ALI的發生、發展有關。因此，本課題擬在課題組前期研究基礎上，探討ASIC1a通道在LPS誘導的ALI大鼠模型肺組織中表達及活性的變化，此變化對大鼠ALI進程的影響，為進一步完善ALI的發病機制研究提供依據，同時也為ALI的防治和新藥研發提供新的靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 32只♂SD大鼠，SPF級，體質量180～220 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證編號為SYXK(皖)2017-006。

1.1.2藥物與試劑 LPS、阿米洛利(美國Sigma公司)；地塞米松(美國Solarbio公司)；細胞組織裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF、一抗稀釋液(上海碧云天生物技術有限公司)；ASIC1a一抗(美國Affinity公司)；β-actin一抗(北京博奧森生物技術有限公司)；TRIzol裂解液(美國Thermo Fisher公司)；ECL顯影液(美國Advansta公司)；ELISA試劑盒(武漢基因美生物技術有限公司)。

1.1.3儀器 Centrifuge 5424R冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；酶標儀MK3(荷蘭雷勃公司)；Western blot設備、化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司 )；熒光倒置顯微鏡 (日本Olympus公司)；FA2004型電子天平 (上海精天天平廠)。

1.2 方法

1.2.1大鼠ALI模型的建立 32只♂SD大鼠按隨機數字表法分為4組：正常對照組(Control組)、ALI組(Model組)、阿米洛利組(Amiloride組)、陽性藥物組(Dex組)。正常組和模型組各腹腔注射生理鹽水2 mL，阿米洛利組和陽性藥組分別腹腔注射2 mL阿米洛利(10 mg·kg-1)和2 mL地塞米松(5 mg·kg-1)，30 min后，正常組腹腔注射1 mL生理鹽水，其余3組腹腔注射1 mL LPS(5 mg·kg-1)。處理完成后，將大鼠放回籠內自由活動，不禁食水。16 h后用戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血，并取肺組織留存。

1.2.2肺組織病理學分析 取大鼠右肺下葉，4%多聚甲醛固定后，常規石蠟包埋、切片，HE染色，封固。光鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.2.3肺組織濕干重比 濕干重比(wet/dry，W/D)是反映肺含水量的重要指標。取各組大鼠右肺前葉組織，稱濕重后，置于70 ℃烘箱內烘干72 h后稱干重，計算肺濕干重比。

1.2.4血氣分析 大鼠麻醉后，用BD preset動脈采血器腹主動脈取血1 mL，送安徽醫科大學第四附屬醫院檢驗科做血氣分析檢測。

1.2.5ELISA法檢測血清TNF-α含量 將取出的血液4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min，分離出血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測各標本血清TNF-α水平。每樣本和標準品均設雙復孔，讀取酶標儀450 nm處吸光度(OD)值，并根據OD值繪制標準曲線，計算各樣本TNF-α含量，取平均值。

1.2.6免疫組化檢測大鼠肺組織ASIC1a表達 取大鼠肺組織右肺葉標本，行免疫組化SP法染色，采用檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol·L-1)高溫高壓抗原修復，常規透膜，5% BSA室溫封閉l h，滴加一抗(1 ∶250)4 ℃過夜。HRP標記的二抗(1 ∶1 000) 37 ℃孵育1 h，DAB顯色，自來水沖洗終止，蘇木精復染10 min后返藍，烤干組織切片，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.7Real-time PCR 使用TRIzol法提取大鼠肺組織總RNA，微量核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度。將mRNA反轉錄為cDNA，real-time PCR檢測各樣本ASIC1a表達，反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，總共38個循環。以β-actin為內參，每組設3個復孔，重復3次，計算平均值。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成，引物序列見Tab 1。

1.2.8Western blot法檢測ASIC1a在肺組織中的蛋白表達 按蛋白提取試劑盒說明書提取肺組織總蛋白，濃度經微量核酸蛋白檢測儀測定。各標本取蛋白樣品進行10% SDS-PAGE電泳，切膠轉膜后，置于5%脫脂牛奶封閉2 h。洗滌，分別孵一抗β-actin(1 ∶1 000)和ASIC1a(1 ∶1 000)，4 ℃過夜。TBST洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育1 h,洗滌后，加入ECL化學發光法顯色成像。用圖像分析處理軟件測定各條帶積分光密度值，以β-actin條帶校正。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理學變化大鼠肺組織HE染色結果如Fig 1所示，正常組肺泡腔結構清晰，間質血管無充血。模型組肺泡正常結構消失，肺間質水腫增寬，肺泡隔增厚，肺泡腔明顯變窄，部分肺泡腔萎陷不張，毛細血管明顯擴張，肺泡腔內炎性細胞浸潤和大量均質紅染樣滲出物，微血栓形成。阿米洛利組和陽性藥物組大鼠肺間質及肺泡出血滲出較模型組明顯減輕。

2.2 各組大鼠肺組織干濕重比的變化肺組織干濕重比(W/D)是反映肺含水量的重要指標。如Fig 2所示，與正常組相比，模型組W/D明顯升高(P<0.01)。阿米洛利組和陽性藥物組W/D值均明顯低于模型組(P<0.01)。

Fig 1 HE staining of lung tissues in each group(×400)

A：Control group；B：Model group；C：Amiloride group；D：Dex group.

Fig 2 Wet dry weight ratio of lung

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS

2.3 各組大鼠血清中TNF-α表達的變化大鼠血清中TNF-α的表達水平如Fig 3所示，模型組血清中TNF-α水平較正常組明顯升高(P<0.01)。阿米洛利組和陽性藥物組血清中TNF-α的水平均明顯低于模型組(P<0.01)。

Fig 3 Expression of TNF-α in

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS

2.4 各組大鼠血氣分析的變化如Tab 2所示，模型組氧氣分壓和pH值均明顯低于正常組(P<0.01)，二氧化碳分壓明顯高于正常組(P<0.01)；阿米洛利組和陽性藥物組氧氣分壓和pH值均明顯高于模型組，二氧化碳分壓明顯低于模型組(P<0.01)。

Tab 2 Rat arterial blood gas analysis

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

2.5 免疫組化檢測各組大鼠肺組織中ASIC1a的表達如Fig 4所示，模型組中ASIC1a的表達量較正常組明顯增多，阿米洛利組和陽性藥物組相比于模型組相對減少。

Fig 4 Immunohistochemistry of ASIC1a in lung tissuesof each group(×200)

A：Control group；B：Model group；C：Amiloride group；D：Dex group.

2.6 各組大鼠肺組織中ASIC1a mRNA的表達變化如Fig 5所示，模型組ASIC1a mRNA的表達量明顯高于對照組(P<0.01)。阿米洛利組(P<0.01)和陽性藥物組(P<0.05)ASIC1a mRNA的表達量與模型組相比明顯下降。

2.7 各組大鼠肺組織中ASIC1a蛋白的表達變化如Fig 6所示，模型組ASIC1a蛋白的表達量明顯高于對照組(P<0.01)。阿米洛利組(P<0.01)和陽性藥物組(P<0.05)ASIC1a蛋白的表達量與模型組相比明顯下降。

Fig 5 mRNA expression of ASIC1a in lung tissues

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS

Fig 6 Protein expression of ASIC1a in lung tissues

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLPS

3 討論

本實驗結果顯示，與正常組相比，模型組氧分壓下降，二氧化碳分壓升高，pH值降低；病理學顯示，其肺組織結構變化與正常組相比，肺泡塌陷，且有大量炎癥滲出液填充。ELISA結果也表明，與正常組相比，模型組血清中TNF-α的表達水平明顯升高，提示造模成功。而與模型組相比，阿米洛利組和陽性藥物組氧氣分壓升高，二氧化碳分壓降低，pH值升高，肺組織病理學明顯好轉，TNF-α的表達水平明顯降低。表明阻斷酸敏感離子通道的活性，能夠有效抑制ALI的發生、發展，使疾病轉歸，趨于好轉。

LPS能增強中性粒細胞活化，導致中性粒細胞浸潤和活性氧、炎性介質的過度釋放，破壞肺泡/毛細血管屏障，致肺組織損傷，形成ALI/ARDS[12]。本實驗采用LPS腹腔注射復制大鼠ALI模型，觀察酸敏感離子通道非特異性阻斷劑阿米洛利對大鼠ALI的影響，從而探究ASIC1a在ALI中扮演的角色。

阿米洛利可以阻斷ENaC Na+/H+交換體和Na+/Ca2+交換體，曾經被用作利尿劑，是ASICs的非特異性阻斷劑，其抑制ASIC1a、ASIC1b和ASIC2a電流的半抑制濃度(IC50)為10～20 μmol·L-1，抑制瞬態ASIC3電流的IC50約為60 μmol·L-1。目前，阿米洛利是用于研究ASICs功能的主要藥理學工具藥之一[11]。目前為止，ASICs的大部分研究主要集中在中樞及外周神經系統中，ASICs參與了腦缺血、癲癇等中樞神經系統疾病的發病，在學習記憶、外周觸覺、痛覺、味覺、機械感覺等的信息傳遞中發揮重要作用[9]。也有文獻報道，酸敏感離子通道開放或在糖尿病肝纖維化的形成過程中，起著重要的促進作用[13]。ASIC1a是ASICs亞基中能通透Ca2+的主要亞基，當胞外pH下降時可被激活[7]。本研究采用免疫組化、qPCR及Western blot實驗，檢測各組大鼠肺組織中ASIC1a的表達情況，探討ASIC1a在LPS誘導的大鼠肺損傷中的表達及作用。結果顯示，與正常組相比，模型組肺組織中ASIC1a的mRNA與蛋白的表達量均明顯增加；與模型組相比，阿米洛利組和陽性藥物組肺組織中ASIC1a的mRNA與蛋白的表達量均明顯下降，其ALI程度較模型組明顯降低。提示ASIC1a可能參與ALI發病，抑制ASIC1a的表達能夠在一定程度上減輕ALI，具體的作用及機制有待于進一步研究證實。

本實驗發現，在LPS致ALI大鼠的肺組織中，ASIC1a的表達量明顯升高，阿米洛利給藥和陽性藥地塞米松給藥后，大鼠的肺組織病理改變減輕，肺組織中ASIC1a的表達量較模型組明顯降低，提示LPS誘導大鼠ALI的機制可能與ASIC1a的激活有關。