探討蠣昆一號制劑對小鼠骨髓抑制的保護作用及其分子機制

靳艷玲，劉國彥，張宇海，洪裕玲，劉 磊，李 龍，葉 蘭

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能實驗室，貴州 貴陽 550025；2. 廈門大學(xué)藥學(xué)院，廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院胃腸外科，福建 廈門 361101)

化學(xué)療法和放射療法是癌癥的主要治療方法，治療過程中會破壞健康細胞[1]，損害造血系統(tǒng)[2]，嚴重者可出現(xiàn)骨髓抑制[3]。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)是臨床常用一線化療藥，作用機制主要是抑制胸苷酸合成酶，以干擾DNA合成，達到抗癌作用[4]。臨床治療中，5-Fu常規(guī)劑量持續(xù)使用不僅殺傷癌細胞，嚴重者還抑制骨髓造血功能，引起骨髓抑制嚴重損傷[5]。蠣昆一號制劑主要由昆布、黃芪、女貞子、茯苓等中草藥組成，具有軟堅散結(jié)，養(yǎng)血活血，清熱利濕，益氣健脾之功效。

JAK/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子(signal transducer and activators of transcription，STAT)信號通路與細胞生長、增殖、分化和成熟關(guān)系密切，其中JAK2/STAT5與紅系細胞的分化成熟密切相關(guān)[6]。已有研究證明，JAK2/STAT5信號通路參與骨髓抑制后的缺血反應(yīng)，促進造血系統(tǒng)恢復(fù)，減輕不良反應(yīng)[7]。本研究擬建立骨髓抑制模型，探究蠣昆一號制劑對5-Fu造模小鼠骨髓造血功能的影響，闡述其減輕小鼠骨髓抑制的作用及其作用機制，同時為中藥復(fù)方制劑對治療腫瘤化療藥所致骨髓抑制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級健康♂ BALB/c小鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量(18～22) g，購自廈門大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(滬)2017-0005。

1.2 藥物與試劑蠣昆制劑由昆布、牡蠣、黃芪、女貞子、茯苓等中藥組成(已申請專利)。蠣昆一號制劑，為蠣昆復(fù)方制劑的一號制劑，簡稱蠣昆一號制劑，由昆布、黃芪、女貞子、茯苓等中草藥組成。昆布、黃芪、茯苓、女貞子(安徽健誠中藥飲片有限公司)；5-Fu(天津金耀藥業(yè)有限公司)；重組人粒細胞刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF)，購自廈門特寶生物工程股份有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、IP細胞裂解液(生工生物工程股份有限公司)；β-actin、JAK2、p-JAK2、STAT5、p-STAT5抗體(Cell Signaling Technology公司)；TNF-α、IL-2的ELISA試劑盒(深圳市達科為生物工程有限公司)。

1.3 儀器ChemiDoc TM XRS+型凝膠成像儀、ImageLab圖像分析系統(tǒng)；全自動血球分析儀BC-2300(上海恒盛醫(yī)療器械有限公司)；DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；iMark酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)。

1.4 模型的建立及分組給藥參照文獻[8]進行骨髓抑制模型造模。將小鼠隨機分為6組，即正常對照組(Control)、模型組(Model)、陽性對照組(rhG-CSF)、蠣昆一號制劑組低(Low)、中(Medium)、高(High)3個劑量，每組10只。模型組小鼠腹腔注射5-Fu 250 mg·kg-1(對照組腹腔注射等容積生理鹽水)，造模24 h后開始給藥，連續(xù)7 d。按文獻[9]計算小鼠蠣昆一號制劑的等效劑量為200 mg·kg·d-1，并以此將蠣昆一號制劑分為低、中、高劑量組，灌胃劑量分別為133、200、300 mg·kg·d-1，灌胃體積為20 mL·kg-1；陽性對照組每只小鼠腹腔注射rhG-GSF 250 μg·kg·d-1，體積為10 mL·kg·d-1。

1.5 一般情況觀察及體質(zhì)量測定每天觀察小鼠的精神狀態(tài)，進食量，每日給藥前測量一次體重。

1.6 外周血細胞計數(shù)各組小鼠最后一次給藥24 h(d 7)后取眼球血。用全自動血細胞分析儀檢測外周血白細胞、血小板、淋巴細胞及單核細胞含量。

1.7 ELISA法檢測TNF-α和IL-2含量各組小鼠最后一次給藥24 h(d 7)后，取眼球血于EP管中，室溫放置0.5 h，4 ℃放置 2 h，3 000 r·min-1離心2次，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.8 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達各組小鼠最后一次給藥24 h(d 7)后，將小鼠頸椎脫臼處死，提取小鼠脾臟組織蛋白，用于p-JAK2和p-STAT5的檢測，將提取的蛋白采用BCA法進行蛋白定量。制樣后SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉2 h，加入一抗β-actin(1 ∶5 000)、JAK2(1 ∶500)、p-JAK2(1 ∶500)、STAT5(1 ∶500)、p-STAT5(1 ∶500),4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，加入山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，漂洗，加入ECL工作液，在凝膠成像儀上顯色，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察正常組小鼠活動正常，糞便正常。模型組小鼠7 d呈明顯的消瘦狀態(tài)，體質(zhì)量不同程度減輕，糞便為水樣糞便。蠣昆一號制劑低、中、高劑量及陽性對照組(rhG-CSF)小鼠腹瀉癥狀改善(Fig 1)。

2.2 體質(zhì)量變化Tab 1結(jié)果顯示，與模型組相比，蠣昆一號制劑低劑量組及陽性對照組小鼠體質(zhì)量差異有顯著性(P<0.05)，中、高劑量組效果不明顯。

2.3 骨髓抑制小鼠外周血象Tab 2結(jié)果顯示，與模型組相比，蠣昆一號制劑及rhG-CSF組外周血白細胞、淋巴細胞均明顯升高(P<0.05)。蠣昆一號制劑中、高劑量血小板均明顯升高(P<0.01)。蠣昆一號制劑及rhG-CSF組外周血淋巴細胞比率均明顯降低(P<0.05)。

Tab 1 Effects of Likun preparation No.1 on bodyweight of mice with

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.4 各組小鼠血清TNF-α和IL-2水平Tab 3的ELISA結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組IL-2含量明顯下降、TNF-α含量明顯上調(diào)；與模型組比較，蠣昆一號制劑中、高劑量組IL-2含量升高(P<0.05)，低劑量組及陽性對照組效果不明顯；蠣昆一號各劑量組及陽性對照組TNF-α含量明顯下降(P<0.05)。

2.5 小鼠脾臟組織中p-JAK2、p-STAT5蛋白表達變化Fig 2的Western blot檢測結(jié)果顯示，模型組小鼠脾臟組織p-JAK2、p-STAT5蛋白表達減少(P<0.05)；與模型組比較，蠣昆一號制劑各劑量組脾臟組織p-JAK2、p-STAT5蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05)。

3 討論

臨床上，造血功能障礙的治療主要是通過直接輸血治療或應(yīng)用一些具有骨髓抑制保護的藥物，如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、促紅細胞生成素等，但這些治療藥物需要不斷重復(fù)給藥，會引起不良反應(yīng)，如外周白細胞減少癥和骨髓抑制。本實驗中，腹腔注射5-Fu，模型組小鼠出現(xiàn)腹瀉、體質(zhì)量下降等癥狀，外周血血細胞(白細胞、淋巴細胞、血小板)數(shù)均明顯降低，表明DNA受損，骨髓抑制形成，這些均提示以250 mg·kg-15-Fu制備骨髓抑制模型是可行的。

Tab 2 Effects of Likun preparation No． 1 on peripheral blood cells of 5-Fu injected mice with hematopoietic injury

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 1 The anal status photo of mouse

A: Control；B: Model；C：rhG-CSF；D：Likun preparation No.1 low dose；E：Likun preparation No.1 medium dose；F：Likun preparation No.1 high dose.

Tab 3 ELISA analysis of TNF-α and IL-2

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 2 Western blot analysis of target

##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsmodel

蠣昆一號制劑主要由昆布、黃芪、媜子和茯苓組成，其主要成分分別為昆布多糖、黃芪多糖、女貞子多糖、茯苓聚糖。其中昆布多糖能預(yù)防高血壓、糖尿病、抗腫瘤和保護血管內(nèi)皮細胞[10]；黃芪多糖能促進小鼠骨髓造血細胞系統(tǒng)恢復(fù)[11]；女貞子多糖具有抗實體腫瘤作用，提高機體免疫力[12]；茯苓聚糖具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性[13]。前期研究發(fā)現(xiàn)，蠣昆一號制劑能提高骨髓造血功能，增強小鼠免疫功能[14]。本研究中，蠣昆一號制劑各劑量組給藥后，骨髓抑制小鼠的外周血淋巴細胞、血小板均有明顯升高，表明蠣昆一號制劑可促進骨髓造血功能的恢復(fù)。造血細胞的增殖和分化受可溶性多肽-細胞因子的調(diào)節(jié)，包括白細胞介素、干擾素、G-CSF和促紅細胞生成素[15]。由IL-2調(diào)節(jié)的造血細胞活化與STAT5和JAK2的激活有關(guān)。IL-2通過調(diào)節(jié)骨髓中T細胞的活性，來幫助維持紅細胞生成[16]。但是，長期化療/放療嚴重損害造血系統(tǒng)，并導(dǎo)致來自宿主細胞促炎癥因子TNF-α釋放，異常TNF-α的分泌可直接抑制骨髓造血功能。小鼠血清ELISA結(jié)果顯示，蠣昆一號制劑給藥后，造血功能障礙的小鼠血清中TNF-α下調(diào)、IL-2上調(diào)，進一步說明蠣昆一號制劑能一定程度上增強小鼠細胞免疫功能，產(chǎn)生抗腫瘤作用。

JAK/STAT途徑廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等過程[17]。5-Fu引起骨髓抑制,導(dǎo)致細胞增殖和分化進程停滯。本實驗檢測p-JAK2和p-STAT5的蛋白表達。結(jié)果顯示，5-Fu引起p-JAK2和p-STAT5蛋白表達降低，表明與造血密切相關(guān)的JAK2/STAT5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也受到了抑制。中、高劑量的蠣昆一號制劑治療后，促進了p-JAK2和p-STAT5的表達，表明蠣昆一號制劑激活了JAK2/STAT5信號通路。由于JAK2/STAT5與紅系細胞分化發(fā)育關(guān)系最為密切[6],我們推測蠣昆一號制劑可能具有促進骨髓造血細胞紅系分化的作用?？傊撗芯康慕Y(jié)果表明，蠣昆一號制劑對5-Fu誘導(dǎo)的小鼠骨髓抑制有保護作用，其作用機制與JAK2/STAT5途徑的激活有關(guān)。