基于腸道屏障功能研究烏司他丁對大鼠術后腸梗阻的影響

戴 琪，黎思彤，陳健文，譚 飛，鄭志華，張志軍，劉培慶，李 民

(1. 中山大學藥學院，新藥成藥性評估與評價國家地方聯合工程實驗室，廣東 廣州 510006；2. 廣東天普生化醫藥股份有限公司，廣東 廣州 510520)

術后腸梗阻(postoperative ileus，POI)是一種常見的腹部外科手術后的并發癥。由于手術的創傷和腹腔的炎癥，造成腸壁水脹并滲出膿液，導致黏連性腸梗阻，進而影響胃腸蠕動[1]。現在已知的POI發病機制主要是兩種：神經機制和炎癥機制。其中，由神經系統介導的主要是在POI的早期階段，手術帶來的創傷和疼痛讓交感神經異常興奮，從而抑制迷走神經，觸發神經炎癥的發生。炎癥機制主要是在POI的持續階段，其過程復雜，也是臨床上的防治重點。這兩種機制間存在著相互影響的交互效應[2-3]。POI的嚴重程度和持續時間決定著病人的術后恢復時間[4]。盡早預防和治療POI能減少病人住院天數，降低醫療費用。

烏司他丁(ulinastatin，UTI)是一種由143個氨基酸組成的人內源性酸性糖蛋白，其蛋白活性功能區被稱為Kunitz結構域，能夠抑制多種水解酶、蛋白酶活性，是一種廣譜的蛋白酶抑制劑。UTI藥理作用廣泛，如抗炎、抗休克作用，穩定溶酶體膜從而抑制多種水解酶活性，神經保護作用，免疫調節作用等。且UTI臨床不良反應少，臨床適應癥眾多，但大部分都與炎癥反應相關。通過其抗炎、抗氧化作用阻斷級聯式炎癥反應，在臨床上廣泛應用于急性胰腺炎的治療[5]。基于以上背景，本研究建立腹腔手術造成的POI大鼠模型，研究UTI對大鼠POI的預防和治療作用，以及對POI大鼠腸道屏障功能的保護作用，初步探討其治療POI及保護腸道黏膜的機制，為今后的POI及UTI臨床研究和治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器UTI(天普洛安公司)；戊巴比妥鈉、伊文氏藍溶液(美國Sigma公司)；TRIzol(日本TaKaRa公司)；RNA逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(美國Thermo公司)；SYBR Green(日本TOYOBO公司)；D-乳酸比色法檢測試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)；內毒素ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)。手術器械(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 動物實驗♂SD大鼠，體質量(200～250) g，實驗編號2017-261DS，購自中山大學動物實驗中心。將92只♂SPF級SD大鼠隨機分為正常對照組(10只)、模型組(10只)、給藥組(共72只，每組8只)。對照組不做任何手術處理。其余大鼠參照文獻報道方法建立術后早期炎性腸梗阻模型[6]。SD大鼠禁食12 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)進行麻醉。在大鼠下腹部正中線切口，暴露全部小腸(胃幽門至回腸末端)，用干燥醫用紗布反復擦拭腸管15 min后縫合傷口。給藥組分為3種給藥途徑：預防組(Pre)在麻醉前1 h尾靜脈注射UTI溶液(溶于生理鹽水)1次；治療組(Tre)在術后24、48 h分別尾靜脈注射UTI溶液(溶于生理鹽水)1次；圍術期組(Peri)在麻醉前1 h和術后24、48 h分別尾靜脈注射UTI溶液(溶于生理鹽水)1次。其中，各給藥組又分為低、中、高(3.0×104、9.0×104、2.5×105U·kg-1)3個劑量。

1.3 胃腸傳輸功能測定手術48 h，用0.15 mL伊文氏藍溶液進行經口灌胃，30 min后腹腔注射3%戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)進行麻醉。開腹取出小腸，在無張力狀態下，測量小腸總長(胃幽門起至回腸末端)和腸管藍染的長度，計算胃腸推進率，胃腸推進率/%=藍染腸管長度/全小腸長度×100%。

1.4 形態學檢測回腸末端組織置于4%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋后，厚5 μm的連續石蠟切片，進行HE染色以及AB/PAS染色。

1.4.1小腸絨毛完整性檢測 每組取6只大鼠HE切片，在倒置熒光顯微鏡下觀察SD大鼠腸絨毛。采用Chiu腸黏膜損傷評分法進行分級評分[7]，根據光鏡下腸黏膜損傷情況，評分一共分為5級：絨毛正常評分為0級；絨毛頂端下間歇增寬評分為1級；絨毛頂端上皮脫落、破潰評分為2級；絨毛頂端破壞擴展到基底部評分為3級；上皮完全脫落評分為4級；固有層崩潰，出現潰瘍及出血點評分為5級。

1.4.2杯狀細胞數量測定 每組取6只大鼠AB/PAS切片，隨機選取視野和選擇5個完整隱窩和小腸絨毛，進行杯狀細胞數量統計。

1.5 D-乳酸、內毒素含量檢測從大鼠腹腔靜脈抽取5 mL血液，在室溫中靜置4 h，再4 ℃靜置過夜，提取分離的血清備用。嚴格按照試劑盒說明書對大鼠血清中D-乳酸和內毒素進行檢測。

1.6 qPCR檢測炎癥因子及腸道屏障相關mRNA的表達取小腸組織20 mg，嚴格按照TRIzoL說明書進行提取組織總RNA實驗操作，逆轉錄合成cDNA后，進行real-time PCR擴增。PCR反應體系由cDNA模板、上下游引物、SYBR Master Mix和DEPC水混合構成，加入離心管中瞬時離心后，置于PCR儀中。參數設定為：95 ℃ 6 min，95 ℃ 6 s，60 ℃ 35 s，循環進行35次。內參為β-actin，每組樣品設置3個復孔。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer design of qPCR

2 結果

2.1 UTI對POI模型大鼠胃腸傳輸功能的影響采用反復擦拭方法進行腸梗阻造模，比較給藥前后的腸道蠕動情況。如Fig 1所示，與對照組相比，模型組胃腸推進率明顯下降，且腸道組織水腫，嚴重黏連并伴有惡臭。與模型組相比，UTI預處理中、高劑量組均能明顯提高胃腸推進率，腸道組織未見明顯水腫黏連。而圍術期組和治療組的低、中、高劑量給藥，均未明顯改善胃腸推進率和腸道組織表型。

2.2 UTI對腸黏膜結構的影響根據對大鼠回腸末端組織HE染色結果，分析比較給藥后腸黏膜形態變化。對照組大鼠小腸組織的無缺損絨毛占有比例高，光鏡下觀察絨毛排列整齊，纖長，斷層絨毛數少；模型組大鼠無缺損絨毛占有比例明顯降低，絨毛排列無序，基本呈斷層碎片狀。UTI預防組中劑量給藥以及圍術期組高劑量給藥后，大鼠無缺損絨毛占有比例明顯高于模型組，而其余治療組無缺損絨毛占有比例變化差異無統計學意義(Fig 2A)。

根據Chiu腸黏膜損傷評分法，進一步對大鼠腸絨毛結構完整性進行評估。Chiu腸黏膜損傷評分法中，絨毛損傷程度越嚴重，評分分數越高。如Fig 2B所示，模型組的腸絨毛上皮幾乎完全脫落，評分最高。UTI預防組和圍術期組中、高劑量給藥后，評分數較低，絨毛結構相對完整，而其余治療組與模型組評分相近，腸絨毛的破損結構沒有明顯改善。

2.3 UTI對POI模型大鼠小腸組織中炎癥因子的影響利用qPCR法檢測小腸組織中的炎癥因子mRNA水平變化。如Fig 3所示，與對照組相比，模型組中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯增加。

Fig 2 Effect of UTI on integrity of small intestinal

A: The arrangement and morphology of intestinal villi observed from HE staining tissue sections and statistics of the ratio of non-defective villi in the intestinal walls(scale bar=50 μm). B: The micrographs of intestinal villi observed from HE staining tissue sections and Chiu scores of each groups(scale bar=50 μm).##P<0.01vsNC;**P<0.01vsSM.

在不同給藥方式處理組中，與模型組相比，預防組中、高劑量能有效降低3種炎癥因子mRNA水平。治療組與模型組相比，炎癥因子mRNA水平未有明顯改變。圍術期組低、中、高劑量均能有效降低IL-6、IL-1β mRNA水平，對TNF-α mRNA水平在均值上有降低，但差異無統計學意義。

2.4 UTI對POI模型大鼠血清D-乳酸、內毒素含量的影響進一步對不同組大鼠血清中的D-乳酸和內毒素含量進行比較。如Fig 4所示，模型組與對照組相比含量明顯增加。與模型組比較，預防組中UTI中劑量組D-乳酸和內毒素含量均明顯下降；治療組3個劑量組均沒有明顯變化，圍術期組中、高劑量給藥D-乳酸和內毒素含量均明顯下降。

2.5 UTI對隱窩和小腸絨毛中杯狀細胞的影響觀察大鼠回腸末端組織AB/PAS染色切片，與對照組相比，POI模型組小腸絨毛上杯狀細胞數目沒有明顯變化，預處理中劑量UTI給藥后，與模型組相比杯狀細胞明顯增加(Fig 5A)。如Fig 5B所示，模型組與對照組比較，隱窩中的杯狀細胞數量大大提升，預處理中劑量UTI給藥后，與模型組對比，杯狀細胞數量明顯下降。

2.6 UTI對小腸組織腸道屏障功能相關mRNA表達的影響如Fig 6所示，與對照組相比，造模組MUC2、MUC3 mRNA水平明顯升高，HD5 mRNA水平明顯下降；預處理組中劑量UTI給藥后，與模型組相比，HD5 mRNA水平明顯升高，MUC2、MUC3 mRNA水平明顯下降。MUC1、HD6 mRNA水平變化差異無統計學意義。

3 討論

POI是腹部外科手術后常見的并發癥，研究者們將POI定義為“手術干預后引起腸蠕動等功能障礙，阻止了腸內容物的有效運輸或者口服攝入的耐受度”。POI關鍵病因之一是炎癥的過度反應，現在臨床上對于POI的預防和治療并沒有理想的方案[8]。UTI是臨床上廣泛用于治療急性胰腺炎的糖蛋白藥物，能夠抑制炎癥細胞的激活和炎癥介質的釋放，是一種廣譜蛋白酶抑制劑[5]。本實驗通過對POI大鼠模型進行不同的UTI給藥方式和劑量的比較發現，預處理中劑量給藥，即在大鼠腹腔造模手術前1 h給予9.0×104U·kg-1UTI能夠有效降低炎癥因子mRNA水平，改善大鼠腹腔手術后腸梗阻造成胃腸傳輸功能下降。此結果提示，腹腔手術前預處理給予UTI，在POI大鼠模型中能夠發揮抗炎作用，有效預防和治療術后腸梗阻。

Fig 3 Effect of UTI on POI-inducedintestinal inflammatory

The mRNA levels of TNF-α(A), IL-6(B) and IL-1β(C) were measured by qPCR.##P<0.01vsNC;*P<0.05,**P<0.01vsSM.

Fig 4 Effect of UTI on POI-induced increasein bacterial metabolites in

A:The level of D-lactate in the different groups;B:The level of endotoxin in different groups.##P<0.01vsNC;*P<0.05,**P<0.01vsSM.

胃腸道的黏膜屏障是先天宿主防御的第一道防線[9]，腸黏膜屏障的一個重要部分是機械屏障，是由腸黏膜上皮細胞以及細胞之間的緊密連接等構成[10]。當腸黏膜屏障受損后，將引起腸壁通透性的增加，致使一些腸道細菌和其代謝物異位入血，加劇腸道炎癥和免疫反應，其中D-乳酸和內毒素就是常見的細菌發酵代謝產物，所以檢測血液中的D-乳酸和內毒素水平能夠反映出腸通透性及其受損程度。研究發現，POI模型大鼠的小腸組織呈現充血水腫的狀態，小腸絨毛結構嚴重破壞，D-乳酸和內毒素水平明顯升高，預處理中劑量UTI給藥后能夠明顯改善這些現象。此結果提示，UTI可以通過修復腸黏膜屏障功能中的機械屏障，降低腸壁通透性，來減緩POI大鼠腸道炎癥。

Fig 5 Effect of UTI on number of goblet

The micrographs of goblet cells observed from AB/PAS staining tissue sections and the statistics of the number of goblet cells of different groups in villi(A) and in crypts(B)(scale bar=100 μm).##P<0.01vsNC;**P<0.01vsSM.

Fig 6 Effects of UTI on mRNA transcription associatedwith intestinal mucosal

A: The mRNA levels of MUC1, MUC2 and MUC3 were measured by qPCR; B: The mRNA levels of HD5 and HD6 were measured by qPCR.#P<0.05,##P<0.01vsNC;*P<0.05,**P<0.01vsSM.

根據以上各組POI大鼠病理生理結果，我們認為UTI預防組中劑量給藥治療POI效果最佳，以預防組中劑量給藥為標準，初步研究了與腸道屏障功能相關的部分指標。除了小腸絨毛外，腸道杯狀細胞分泌出的各種黏蛋白、水以及無機鹽等，構成了凝膠樣的黏液層以保護腸上皮細胞，抵御外界病原生物等的侵犯和維持腸道內環境穩態[11]。杯狀細胞由腸道隱窩基底處的干細胞分化而成，從隱窩基底向絨毛頂端遷移成熟，變成典型的杯狀形態[12]。根據杯狀細胞數量統計結果推測，POI大鼠腸黏膜屏障被破壞，刺激隱窩處干細胞分化，黏液細胞分泌增加，杯狀細胞數量明顯增加。UTI給藥后，杯狀細胞遷移生長速度加快，絨毛處杯狀細胞明顯增加，而隱窩處杯狀細胞數量明顯降低。根據杯狀細胞分泌黏蛋白MUC1、MUC2、MUC3 mRNA的變化，推測大鼠腸道屏障受損，機體會自發增加黏蛋白的分泌，保護腸道，UTI給藥后，通過抗炎和修復小腸絨毛，加快了疾病恢復，MUC2和MUC3蛋白相應減少。

α-防御素是一種抗菌多肽，由小腸上皮細胞中的潘氏細胞分泌，同杯狀細胞分泌的黏蛋白一樣，也是腸黏膜屏障的重要部分，主要起到溶菌和殺菌等作用。HD5和HD6是人體內分泌出現的兩種α-防御素，在腸道天然免疫中發揮著重要作用[13]。根據本實驗結果推測，腸黏膜屏障破壞會影響HD5蛋白的分泌，而UTI可以恢復甚至刺激這種蛋白的分泌，來抵御外來的破壞，維持腸道穩態。

綜上所述，預處理中劑量UTI給藥能有效預防和治療術后腸梗阻大鼠。在POI大鼠中，UTI能夠發揮抗炎作用，維持小腸絨毛以及腸黏膜屏障的完整性。本研究結果對UTI治療術后炎性腸梗阻提供了一些理論依據，同時初步探索了POI大鼠模型中UTI對腸道屏障功能的影響。

(致謝：本實驗在中山大學藥學院藥理毒理實驗室完成，在此對給予實驗幫助的老師和同學表示感謝。)