七葉皂苷鈉作用EIF4A1抑制肝癌細胞增殖的研究

王 石，周大臣，崔 笑，張 彬，侯 輝，耿小平

(安徽醫科大學第二附屬醫院肝膽外科，安徽 合肥 230601)

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤，由于其惡性程度高，治療方法有限，多數患者就診時已屬晚期，其預后較差[1]。隨著分子生物學和腫瘤基因組學的研究進步，越來越多的與肝癌發展相關的分子生物學機制被證實[2-4]，因此，作用于相關靶點藥物的研究具有重要意義。研究表明，細胞內mRNA翻譯的失衡在腫瘤的發展中具有重要作用[5]，EIF4A1作為真核起始因子4F(eukaryotic initiation factor 4F，EIF4F)復合物中含量最豐富的亞基，在翻譯起始階段調控著蛋白質的合成過程[6-7]。已有文獻報道，EIF4A1的表達與某些腫瘤的發生、發展相關，如肺癌、乳腺癌、宮頸癌等[8-10]，但是EIF4A1與HCC的發展是否存在聯系，并沒有相關研究。

七葉皂苷鈉(sodium aescinate)是來源于中藥婆羅子的提取物之一，作為提取成分中含量最高的提取物，七葉皂苷鈉具有較高的臨床應用價值，包括抗炎、抗氧化、保護血管、糾正腦功能失常等生物學作用[11]，但是其是否具有抗腫瘤作用卻鮮有研究。本課題組在前期研究中證實，七葉皂苷鈉具有抑制肝癌細胞系生長增殖的作用，但其作用機制尚不完善。本研究中，我們將在HCC患者的組織標本中檢測EIF4A1的表達情況，并結合臨床數據及隨訪信息分析其相關性；再進一步探索七葉皂苷鈉抑制肝癌細胞系的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本與臨床信息 收集安徽醫科大學第二附屬醫院普外科2008年至2015年間，以及安徽醫科大學第一附屬醫院2000年至2015年間HCC患者的腫瘤標本及每位患者的病例信息，共100例。期間對100名患者進行間隔為3個月1次的隨訪，隨訪內容包括病人生存情況、血清AFP、肝功能、HBV-DNA以及超聲檢查。最后隨訪日期為2018年7月30日。上述所有標本在收集及運輸過程中均有低溫保護措施，并于標本庫-80 ℃長期保存。通過術前診斷，所有納入患者均未進行任何抗癌治療，病人的CT、磁共振等影像學檢查結果顯示腫瘤未發生遠處器官的轉移，所有病人的手術治療均滿足根治性切除的標準。最終由于失訪及臨床資料缺失等原因，共有80例納入研究。80例標本組織交由武漢艾薇兒公司進行組織切片的制作，每例4張。本研究已通過安徽醫科大學附屬醫院倫理審查委員會的批準。

1.1.2藥物與試劑 七葉皂苷鈉(CFN99509，ChemFaces)；超靈敏兩步免疫組織化學套盒PV-9001(北京中杉金橋生物技術有限公司)；兔抗EIF4E單克隆抗體(ab76256)、兔抗EIF4A1多克隆抗體(ab31217)，均購自Abcam公司；凋亡試劑盒(556547，BD公司)；Trizon Reagent(美國Invitrogen Life Technologies公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa公司)；免疫熒光染色試劑盒-抗兔Cy3(碧云天公司)。

1.1.3細胞系 肝癌細胞株HepG2、人正常肝細胞株L02，均購自上海生命科學院細胞典藏庫。

1.1.4儀器 Western blot顯影儀(天能公司)；精密恒溫二氧化碳細胞培養箱、qPCR儀(Thermo Fisher公司)；酶標儀(上海科華生物工程股份有限公司)；熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)；流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 按步驟進行免疫組織化學染色：先將切片置于70 ℃溫箱中30 min進行脫蠟，再于二甲苯中進一步脫蠟，接著依次用無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇進行脫水處理，在高溫壓力鍋中放置裝有枸櫞酸鈉緩沖液的切片盒，切片于其中進行抗原修復3 min。用3%過氧化氫進行內源性過氧化物酶阻斷后，用牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h。接著4 ℃冰箱中孵育一抗(1 ∶100)過夜。d 2常溫孵育二抗1 h后，進行DAB染色。顯微鏡下觀察結果。

1.2.2細胞培養 DMEM高糖培養基加入10%血清和1%雙抗用于細胞系的培養，培養條件為37 ℃，CO2濃度為5%。每3 d進行培養基更換，每5 d用含有EDTA的胰酶消化后進行傳代，細胞離心速度1 500 r·min-1×5 min。

1.2.3Western blot檢測 用七葉皂苷鈉(40 μmol·L-1)處理6孔板種植的細胞72 h后，在6孔板中加入RIPA和蛋白酶抑制劑混合液(100 ∶10)，30 min后離心提取蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度。在10% SDS聚丙烯酰胺凝膠孔中加入等體積、等濃度的蛋白樣品，進行凝膠電泳，濃縮膠電泳條件80 V、30 min，分離膠電泳條件120 V、60 min。200 mA恒定電流轉膜1 h后用BSA封閉，4 ℃過夜孵育一抗(1 ∶1 000)，次日TBST清洗10 min×3次后，室溫孵育二抗(1 ∶10 000)1 h，顯影拍照，運用ImageJ測量灰度值分析。

1.2.4qPCR檢測 在6孔板中種植細胞后，加藥組經七葉皂苷鈉(40 μmol·L-1)處理72 h后，每孔加800 μL Trizon，冰上消化10 min后，按5 ∶1的比例加氯仿，置于冰上待其分層后離心，取上清液，再加入與上清液等體積的異丙醇，于-20 ℃冰箱助沉30 min后離心，用無酶水配制的75%乙醇洗滌后離心、干燥，加入20 μL無酶水，震蕩離心。RNA提取完成后測濃度，定量；在10 μL體系下進行逆轉錄，于八連管中進行qPCR。引物序列見Tab1。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.2.5細胞免疫熒光 采用細胞爬片技術將細胞種植于6孔板中，七葉皂苷鈉(40 μmol·L-1)處理72 h結束后，用4%的多聚甲醛固定15 min，0.03% Triton X-100穿孔、封閉，再于4 ℃冰箱中過夜孵育一抗(1 ∶1 000)。次日室溫下避光孵育熒光二抗1 h，DAPI染色2 min后，用PBS清洗干凈，DAKO封片后避光干燥，熒光顯微鏡下拍攝結果。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞種于6孔板中，在七葉皂苷鈉(40 μmol·L-1)處理72 h后消化計數，預冷的PBS洗滌。將離心后的細胞用1×PBS緩沖液重懸并計數，將濃度稀釋為1×109·L-1，取100 μL細胞懸液加入流式管中，再用5 μL Annexin V和5 μL PI進行細胞標記，于室溫下避光孵育15 min。完成后用緩沖液將流式管中細胞懸液補充至500 μL，1 h內用流式細胞儀檢測凋亡。

1.2.7Transwell實驗檢測細胞遷移能力 細胞接種6孔板，七葉皂苷鈉(40 μmol·L-1)處理72 h后消化細胞，用未加血清的DMEM重懸細胞并計數。將細胞濃度稀釋為每毫升2×104個細胞，于Transwell小室加入200 μL稀釋后的細胞懸液。培養24 h后甲醇固定，結晶紫染色。純水洗凈染液后，用棉簽將小室內的細胞擦拭干凈，于倒置顯微鏡下觀察并拍攝結果。

1.2.8MTT實驗 取對數生長期的HepG2細胞，以每孔3×103個細胞接種96孔板，用1、2、4、6、8、10 μmol·L-1的索拉非尼處理細胞72 h，每個濃度設兩個復孔，每組設置1個對照組。72 h后每孔加入10 μL MTT溶液(2.5 g·L-1)，37 ℃孵育4 h后，每孔加入150 μL異丙醇，震蕩溶解10 min，使用酶標儀在570 nm測量吸光度值，計算細胞存活率。

1.2.9統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。臨床指標與蛋白表達相關性分析采用卡方檢驗。通過ImageJ軟件進行蛋白灰度值的測量及遷移實驗細胞的計數，結果通過T檢驗分析；Gehan-Breslow-Wilcoxon test用于生存曲線差異性檢驗。

2 結果

2.1 EIF4A1在肝癌組織中高表達，且其與腫瘤組織分化、直徑及病人生存期相關80名患者的各項臨床指標及EIF4A1的表達情況見Tab 2。免疫組織化學染色結果顯示(Fig 1A)，在44例高表達患者中，腫瘤組織細胞質中EIF4A1的表達量相較于癌旁組織明顯增高。結合臨床數據提示，EIF4A1的高表達與腫瘤病理學分化及腫瘤大小兩項臨床指標呈正相關，且差異具有統計學意義(P<0.01)。而在性別、年齡、血清AFP、HBV-DNA、Child分級等指標中的表達，差異無統計學意義。生存分析顯示(Fig 1B)，EIF4A1低表達的病人生存期明顯偏高，較EIF4A1高表達病人的生存期差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 七葉皂苷鈉可抑制肝癌細胞的遷移能力本課題組在前期研究中通過MTT實驗，已獲得七葉皂苷鈉抑制肝癌細胞系增殖的IC50結果[12](IC50=46 μmol·L-1)。本研究延用40 μmol·L-1七葉皂苷鈉處理HepG2和L02細胞系72 h后，通過Transwell實驗發現(Fig 2A)，加藥后的HepG2細胞遷移能力明顯降低(P<0.01),正常肝細胞系L02經七葉皂苷鈉處理后，遷移能力與對照組比較差異無統計學意義。

2.3 七葉皂苷鈉可誘導HepG2細胞凋亡流式細胞儀檢測結果顯示(Fig 2B)，40 μmol·L-1七葉皂苷鈉處理后，HepG2細胞的凋亡率明顯增高，而正常肝細胞的凋亡率無明顯變化。

Tab 2 Correlation analysis between clinical indexes andexpression of EIF4A1 in 80 patients with HCC

2.4 七葉皂苷鈉下調HepG2細胞EIF4A1的表達Western blot實驗發現(Fig 3A)，40 μmol·L-1七葉皂苷鈉處理HepG2及L02細胞后，HepG2細胞中EIF4A1的表達量明顯下調，作為EIF4A1首要激活物，EIF4E的表達量也同時降低(P<0.01)，而正常肝細胞系中EIF4A1的表達組間差異無統計學意義。細胞免疫熒光實驗也發現(Fig 3C)，七葉皂苷鈉可明顯下調HepG2中EIF4A1的表達，結果與Western blot一致。qPCR結果顯示(Fig 3B)，七葉皂苷鈉明顯下調HepG2細胞中EIF4A1 mRNA水平，差異具有統計學意義(P<0.01)。

2.5 索拉非尼抑制HepG2細胞增殖的同時不影響EIF4A1的表達MTT實驗發現(Fig 4A)，索拉非尼對HepG2細胞的增殖具有抑制作用,且有濃度依賴性。用10 μmol·L-1的索拉非尼處理HepG2細胞72 h后提取蛋白，Western blot實驗發現(Fig 4B)，索拉非尼抑制HepG2細胞生長的同時，不影響EIF4A1及EIF4E的表達。

Fig 1 Expression of EIF4A1 in tumor tissues and adjacent paracancerous tissues and its subsistence analysis

A:Expression of EIF4A1 in tumor tissues was significantly higher than that in paracancerrous tissues; B:Patients with low expression of EIF4A1 had a relatively long survival period, with significant statistical differences(P=0.0056).

A:Transwell was used to detect the change of migration ability of two cell lines after sodium aescinate treatment; B:After sodium aescinate treatment, the apoptosis rate of HepG2 significantly increased; however, sodium aescinate had little effect on the apoptotic rate of L02.**P<0.01vscontrol.

3 討論

七葉皂苷鈉作為臨床常用的消炎驅腫藥物，在腫瘤治療方面的相關研究較少，有研究提示七葉皂苷鈉在乳腺癌中具有一定的抗腫瘤作用[13]，但其在肝癌中是否具有抑制作用及其分子機制并不清楚。我們前期的研究結果證明，七葉皂苷鈉可通過NF-κB信號通路，抑制肝癌細胞系的增殖，并且對正常肝細胞系(HL-02)無毒副作用[12]。此外，七葉皂苷鈉與目前HCC一線治療藥物索拉菲尼相比，能達到相似的肝癌細胞系抑制作用。這些研究均證實了七葉皂苷鈉在抗腫瘤方面具有一定的潛在價值。

A:Western blot was used to detect the expression of EIF4A1 and EIF4E; B:qPCR in HepG2 decreased after sodium aescinate treatment; C:Immunofluorescence was used to detect the expression of EIF4A1 in two cell lines.**P<0.01vscontrol.

Fig 4 Effect of sorafenib on HepG2 cell

A:Effect of different concentrations of sorafenib on HepG2 for 72 h; B:Western blot was used to detect the expression of EIF4A1 and EIF4E in HepG2 at a concentration of 10 μmol·L-1for 72 h.

在本研究中，我們進一步從mRNA翻譯的調控方面，探索七葉皂苷鈉抑制HCC更深入的分子生物學機制。EIF4A1作為真核起始因子復合物EIF4F的重要組成部分，在mRNA翻譯調控進程中起著解螺旋酶的功能[14]，因此，EIF4A1的表達對mRNA翻譯的調控起著重要的調節作用。本課題通過高通量組織切片分析發現，EIF4A1的表達對肝癌組織的分化及大小有重要影響，EIF4A1高表達的患者，腫瘤趨向低分化且腫瘤體積偏大；并且通過生存分析發現，EIF4A1高表達的患者的術后生存時間明顯降低。這些結果提示翻譯起始因子EIF4A1在肝癌的發生、發展中具有一定的作用。通過體外實驗發現，七葉皂苷鈉抑制肝癌細胞系增殖的同時，可下調EIF4A1的表達，而且誘導肝癌細胞系凋亡及抑制其遷移能力。這些作用可能是七葉皂苷鈉作用于EIF4A1得到的綜合結果。而在正常肝細胞系中，這種現象卻不明顯。通過索拉非尼對照實驗發現，作為唯一批準用于HCC的一線分子靶向藥物，索拉非尼在抑制肝癌細胞系增殖的基礎上，并不會對EIF4A1及EIF4E產生影響。這進一步證明了七葉皂苷鈉的獨特作用機制。目前，臨床上用于肝癌治療的主要一線藥物只有索拉非尼，但是由于其耐藥情況，加之較高的價格，并不能為多數患者所接受，所以發現一種新的有效藥物迫在眉睫。在后期的研究中，我們將進一步完善七葉皂苷鈉在HCC中的作用機制，并為其臨床應用提供研究基礎。