RGS4過表達對甲基苯丙胺依賴大鼠紋狀體mGluR5信號傳導通路相關蛋白表達的影響

趙林波，隋念含，蒙國懿，洪仕君，李利華，邢豫明，趙永娜

(1.云南中醫藥大學信息學院，云南 昆明 650500；2. 昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；3. 昆明醫科大學法醫學院，云南 昆明 650500；4. 云南省公安廳禁毒處毒品分析與禁毒技術公安部重點實驗室，云南 昆明 650228)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)俗稱“冰毒”，作為一種具有精神活性的新型合成毒品，其依賴的發生發展機制十分復雜，涉及腦內多個腦區、多條神經環路、多信號分子的共同調節[1-2]。其中，紋狀體在激發和維持運動、情緒控制、獎賞效應和藥物依賴中扮演著重要角色[3]。紋狀體內含有豐富的G蛋白信號調節因子4(regulator of G-protein signaling 4，RGS4)和代謝型谷氨酸受體5(metabotropic glutamate receptor subtype 5，mGluR5)[4]。大量研究表明，RGS4蛋白在苯丙胺[4]、可卡因[5]、嗎啡[6]等藥物成癮的調節機制中均扮演了重要角色，作為G蛋白信號通路的負性調節因子，它能負性調節一些與Gαi和Gαq亞基偶聯的受體信號因子作用的持續時間及強度[7]。mGluR5是一類重要的G蛋白偶聯受體(G-protein coupled receptors,GPCRs)，它可與Gαq偶聯，并激活磷脂酶C-β1(phospholipase C-β1, PLCβ1)，介導甘油二脂(diacylglycerol，DAG)和1，4，5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-triphohate，IP3)雙信使信號通路，參與藥物成癮行為的調節[4]。

國外已有不少研究探討了嗎啡、可卡因等成癮性藥物使用后，RGS4和mGluR5介導的信號通路的變化情況。本研究采用METH依賴使大鼠紋狀體內RGS4蛋白過表達的方法，觀察大鼠行為學變化，以及腦紋狀體內RGS4、mGluR5、Gαq、PLCβ1蛋白表達的變化，為進一步研究RGS4和mGluR5受體信號通路在藥物依賴的發生、發展中的作用提供理論基礎。

1 材料

1.1 實驗動物健康SD大鼠50只，♂，體質量(230±20)g，由昆明醫科大學實驗動物學部提供，生產許可證號：SCXK(滇)K2015-0005。

1.2 藥物與試劑甲基苯丙胺鹽酸鹽，由云南省公安廳禁毒處毒品分析與禁毒技術公安部重點實驗室合法提供；過表達腺病毒載體Ad5-RGS4-EGFP(病毒滴度為1.6×1013PFU·L-1)、陰性對照腺病毒載體Ad5-EGFP，均購自博淼生物科技(北京)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京天根生化公司)；兔抗RGS4多克隆抗體、鼠抗mGluR5單克隆抗體(Abcam公司)；兔抗Gαq單克隆抗體、兔抗PLCβ1多克隆抗體(Santa Cruz公司)；兔抗GAPDH單克隆抗體(SAB公司)。

1.3 儀器大鼠腦立體定位儀和牙科鉆(深圳瑞沃德公司)；微量進樣器(上海玻璃儀器廠)；鼠博士動物行為學分析系統(上海移數信息科技有限公司)；全波長酶標儀(Thermo公司)；垂直電泳儀和膜轉印裝置Mini Protein 3(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 攜帶EGFP的過表達腺病毒載體Ad5-RGS4-EGFP轉導效率研究根據George Paxinos和Charles Watson的《大鼠腦立體定位圖譜》[8]，反復進行定位點校正后，確定大鼠紋狀體立體定位注射靶點為：前囟前0.5 mm，中線旁開±3.0 mm，深距顱骨表面5.2 mm。用微量進樣器抽取過表達腺病毒載體Ad5-RGS4-EGFP，按上述靶點坐標鉆顱并勻速緩慢注射，每側3 μL，病毒數量為4.8×107PFU，注射速度為0.2 μL·min-1，注射完畢后，針頭留置10 min后再緩慢拔出，縫合切口，于術后d 3、7、11進行心臟灌注固定，避光取腦，制作冰凍切片，立即取含有紋狀體的切片，于倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP在腦紋狀體內的表達情況，以EGFP表達間接評估目的蛋白RGS4在紋狀體內的表達；同時以正常大鼠相同部位腦切片作為對照。

2.2 實驗動物分組及腦紋狀體立體定位注射大鼠隨機分為5組：正常組、生理鹽水(normal saline，NS)組、METH組、Ad5-RGS4-EGFP組、Ad5-EGFP組，每組10只。以微量進樣器抽取過表達腺病毒載體Ad5-RGS4-EGFP，按上述靶標、劑量、方法勻速緩慢注入Ad5-RGS4-EGFP組大鼠紋狀體內；同法抽取陰性對照腺病毒載體Ad5-EGFP注入Ad5-EGFP組大鼠紋狀體內；抽取磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS)注入NS組、METH組大鼠紋狀體內；正常組大鼠不做任何處理。次日，建立大鼠METH依賴的條件位置偏愛(conditioned place preference，CPP)模型。

2.3 CPP模型的建立參照Niwa等[9]的方法，進行METH依賴CPP模型建立。預測期：大鼠在CPP測試箱內自由活動3 d，每天1次，每次15 min，d 3記錄每只大鼠在白箱和黑箱的平均停留時間，確定大鼠的天然偏愛傾向(本實驗為黑箱)，將白箱定為伴藥箱；剔除以白箱為天然偏愛箱及活躍性較差的大鼠。給藥及條件化訓練期：d 4，Ad5-RGS4-EGFP組、Ad5-EGFP組、METH組大鼠腹腔注射METH 10 mg·kg-1·d-1(早上8 ∶00)，NS組大鼠給予相同劑量的生理鹽水后，放入白箱內關閉通道觀察30 min；次日，各組大鼠均注射生理鹽水，放入黑箱內關閉通道觀察30 min，如此共進行3個循環，共訓練6 d；后測期：d 10開放通道，使大鼠在黑白兩箱內自由活動，觀察15 min，記錄動物在白箱停留時間，計算CPP差值，CPP差值=CPP后測值-CPP前測值，并對各組值分別進行統計學分析。正常組大鼠不做任何處理。

2.4 Western blot檢測CPP測試結束后，處死大鼠，于冰上迅速剝離大腦并取出紋狀體，使用RIPA和PMSF冰上裂解紋狀體組織，提取總蛋白后，用BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白經SDS-PAGE電泳后，轉至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；分別加入RGS4、PLCβ1、mGluR5、Gαq抗體(RGS4稀釋比為1 ∶500，Gαq、PLCβ1均為1 ∶1 000，mGluR5為1 ∶5 000稀釋)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜；加入HPR標記的二抗(1 ∶6 000稀釋)，搖床上室溫孵育2 h；TBST洗膜；取膜于暗室內加入ECL，在熒光和化學發光成像系統中曝光不同時間后，拍照成像保存。用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析目標條帶和對應的內參GAPDH條帶的平均光密度值，對二者比值進行統計分析。

3 結果

3.1 Ad5-RGS4-EGFP注入紋狀體后介導的EGFP表達實驗大鼠注射Ad5-RGS4-EGFP后d 3、7、11，均可在熒光激發下觀察到EGFP在紋狀體注射區內有明顯表達，且熒光強度在不同實驗大鼠及不同時間呈現區域穩定；而正常大鼠腦切片紋狀體部位沒有觀察到綠色熒光。見Fig 1。

3.2 Ad5-RGS4-EGFP對METH處理大鼠CPP實驗的影響Tab 1結果顯示，各組大鼠CPP前測試值差異無統計學意義(P>0.05)，表明立體定位注射手術沒有引起實驗大鼠行為學改變，提示后續CPP測試具有良好的可比性。CPP差值比較：與NS組比較，METH組CPP差值明顯增加(P<0.01)，提示METH依賴CPP模型建立成功，Ad5-RGS4-EGFP組CPP差值也增加(P<0.05)；與METH組比較，Ad5-EGFP組CPP差值無明顯差異(P>0.05)，提示腦紋狀體內注射腺病毒載體對METH依賴CPP行為無影響，Ad5-RGS4-EGFP組CPP差值減少(P<0.05)，提示腦紋狀體內注射Ad5-RGS4-EGFP使RGS4過表達后，可減弱METH引起的CPP行為，但與NS組比較的結果提示還不能徹底消除CPP行為。

*P<0.05,**P<0.01vsNS;#P<0.05vsMETH

3.3 大鼠紋狀體內RGS4、mGluR5、Gαq、PLCβ1蛋白表達情況Fig 2、Tab 2結果顯示：與NS組比較，正常組RGS4、mGluR5、Gαq、PLCβ1四個蛋白表達差異均無顯著性(P>0.05)，METH組RGS4蛋白表達水平降低(P<0.05)，mGluR5、Gαq、PLCβ1蛋白表達水平均升高(P<0.05)；與METH組比較，Ad5-EGFP組RGS4、mGluR5、Gαq、PLCβ1四個蛋白表達差異均無顯著性(P>0.05)，Ad5-RGS4-EGFP組RGS4蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，提示腦紋狀體內注射過表達腺病毒載體Ad5-RGS4-EGFP可使METH依賴大鼠腦紋狀體RGS4蛋白成功過表達，mGluR5、Gαq蛋白表達水平均降低(P<0.05)，PLCβ1蛋白表達水平略有降低(P>0.05)，提示腦紋狀體內RGS4蛋白過表達后，可使mGluR5、Gαq表達水平降低，差異有統計學意義，PLCβ1表達水平略有降低，但差異無統計學意義。

Fig 2 Change of RGS4, mGluR5, Gαq, PLCβ1protein expression in striatum of experimental rats

4 討論

本實驗通過將過表達腺病毒載體Ad5-RGS4-EGFP注入METH依賴大鼠紋狀體，使RGS4蛋白過表達，研究RGS4調控的mGluR5蛋白及其下游Gαq和PLCβ1相關蛋白表達變化，以及對大鼠CPP行為的影響，探討其在METH成癮中的作用。本實驗用腺病毒載體作為轉染載體，有安全性高、外源基因表達水平較高、病毒滴度高、感染范圍廣等特點[10]，它對神經組織有很高的轉染能力，因而對于本研究較其他病毒載體具有更大優勢[11]。CPP是一種常用的藥物獎賞效應以及藥物渴求研究的動物模型，是評估藥物依賴精神依賴性最方便、常用、經典的實驗，其通過對成癮物質獎賞效應的體驗是否產生偏愛，來評價成癮物質精神依賴的程度[12]。本研究結果顯示，大鼠紋狀體RGS4過表達可減弱METH依賴CPP效應，但不能消除，可能是本實驗中只對紋狀體中的RGS4蛋白表達進行了干預，而其他成癮相關腦區及其他信號通路的作用卻并未受到影響，所以成癮行為只能減弱而無法消除。Kim等[13]的研究也發現，小鼠腦伏隔核內RGS4敲除后，可卡因成癮行為明顯增強，與本實驗結果相似。

本實驗前期研究發現，METH依賴可導致大鼠腦紋狀體RGS4蛋白表達下調，以及mGluR5、Gαq、PLCβ1蛋白表達上調[14]。現階段RGS4過表達后，可加強對G蛋白偶聯受體mGluR5的負性調控作用，使該通路中相關蛋白迅速失活，即RGS4與mGluR5、Gαq、PLCβ1形成穩定復合物，RGS4表達升高抑制了mGluR5活化，從而阻斷了PLC介導磷脂酰肌醇信號通路。Mao等[15]研究闡明，PLCβ1是磷脂酰肌醇信號途徑的重要分子，是mGluR5的Gαq亞單位主要的作用對象，它與阿片類藥物成癮的易感性密切相關。

Schwendt等[16]研究也發現，使背側紋狀體內RGS4過表達，可減弱由苯丙胺或mGluR5激動劑誘導的動物行為活性和降低ERK磷酸化水平，與使用mGluR5拮抗劑有相似的效果。Mathews等[17]研究還發現，長期可卡因成癮大鼠經過20 d的戒斷后，大鼠腦背側紋狀體內RGS4表達降低，并激活了Gαq下游信號通路。本實驗發現，成癮大鼠紋狀體RGS4過表達后，mGluR5、Gαq、PLCβ1表達呈現出不同程度的降低趨勢，其中mGluR5、Gαq降低程度較為明顯，與Schwendt等和Mathews等的研究結果一致。這可能是因為RGS4蛋白的過表達，加強了對mGluR5受體信號通路的負性調控作用，使該通路中相關蛋白迅速失活，從而阻斷PLC系統介導的磷脂酰肌醇信號通路所致。PLCβ1作為磷脂酰肌醇信號途徑的重要信號分子，被Gαq激活后，可催化質膜磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)水解為DAG和IP3，從而調節細胞內Ca2+水平[18]。另外，mGluR5也可被Gαq強烈激活，并與PLC途徑相偶聯[19]。RGS4與Gαq間也有直接的作用[20]。因此，RGS4過表達可能通過抑制mGluR5介導的磷脂酰肌醇信號通路，從而使mGluR5、Gαq、PLCβ1表達水平降低，對METH依賴起了一定的抑制作用。

本實驗以RGS4作為研究靶點，為治療METH依賴提供了一個新思路和著力點。但鑒于METH成癮涉及眾多腦區及多條受體信號通路，因此，后續研究將綜合多個重要的成癮相關腦區和多條信號通路進行深層次探討。

(致謝：本實驗在昆明醫科大學藥學院、法醫學院、基礎醫學院實驗室內完成，對本實驗辛勤付出的各位老師、同學表示衷心感謝。)