黃芪建中湯對大鼠十二指腸潰瘍及TLR-2介導的腸黏膜免疫屏障的影響

宋厚盼，陳小娟，曾梅艷，陳新怡，蔡 雄，喻 嶸，謝明霞， 彭清華

(湖南中醫藥大學 1. 中醫診斷研究所、2. 中醫學院，湖南 長沙 410208)

十二指腸潰瘍(duodenal ulcer, DU)是臨床常見的一種消化系統疾病，其病因主要包括幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, HP)感染、服用非甾體類藥物、精神心理因素、不良生活飲食習慣等，典型的臨床癥狀表現為慢性、周期性、節律性的上腹部或劍突下疼痛，空腹疼痛加重，進食緩解[1]。近年來，DU發病率呈逐年升高趨勢，嚴重影響了人們的生命健康和生活質量。盡管當前抑酸藥、抗生素和黏膜保護藥物的應用，使大多數患者獲得較好的短期療效，但如何加速潰瘍愈合、防止潰瘍復發、減少并發癥和不良反應發生，仍然是DU臨床和基礎研究重點關注的問題[2]。

黃芪建中湯(Huangqi Jianzhong decoction, HQJZ)是歷代醫家治療內科脾胃病及其他各科病見脾胃虛損證的常用方劑，本方由黃芪、飴糖、桂枝、白芍、生姜、甘草和大棗組成，具有溫中補虛、緩急止痛之功效。消化性潰瘍中醫診療專家共識意見[3]和消化性潰瘍中西醫結合診療共識意見[4]均建議以本方為主方隨證加減治療脾胃虛寒型DU患者，但目前有關HQJZ治療DU的基礎研究較少。本研究通過構建大鼠DU模型，探討HQJZ促進潰瘍愈合的藥理效應及其對十二指腸黏膜免疫屏障功能的影響，揭示其治療DU的分子機制，為中醫藥或中西醫結合療法在臨床應用于消化性潰瘍疾病的治療提供科學依據。

1 材料

1.1 實驗動物SD大鼠，♂，SPF級，體質量(180±20)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(湘)2016-0002。每籠6只飼養，環境溫度(23±2)℃，相對濕度45%～55%，12 h光暗周期循環。適應性喂養3 d后開始正式實驗。

1.2 試劑大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)試劑盒(CRE0003)、大鼠白細胞介素10(interleukin-10, IL-10)試劑盒(CRE0007)，均購于北京四正柏生物科技有限公司；大鼠白細胞介素4(interleukin-4, IL-4)試劑盒(70-EK304/2-48)購于聯科生物；總RNA提取試劑(B518621)、M-MuLv第一鏈cDNA合成試劑盒(B532435)、SG Fast qPCR Master Mix(B639271)，均購于生工生物工程有限公司；兔抗髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)一抗(bs-1047R)、兔抗Toll樣受體2(Toll-like receptor, TLR-2)一抗(bs-10472R)，均購于北京博奧森生物技術有限公司；伊紅染液(批號：150109)、DAB顯色試劑盒(批號：ZLI-9018)，均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

Fig 1 Schematic diagram of establishing rat model of duodenal ulcer with syndrome of spleen and stomach deficiency-cold

1.3 藥物阿司匹林(批號：BJ38595，拜耳醫藥保健有限公司)；埃索美拉唑腸溶膠囊(批號：G170815，重慶萊美藥業股份有限公司)；HQJZ組方藥物，購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，本方由膠飴30 g、桂枝9 g、白芍18 g、黃芪5 g、甘草6 g、生姜9 g、大棗4枚組成(參照《方劑學》第十版教材，中國中醫藥出版社，李冀主編)。按原方比例混合除膠飴外的全部藥材，以蒸餾水(m ∶V=1 ∶8)浸泡1 h，電熱套煎煮40 min，紗布過濾。以相同體積的蒸餾水重復提取1次，過濾，合并兩次濾液，加入膠飴使之溶解，減壓濃縮至每毫升藥液含HQJZ生藥1 g。根據人和動物體表面積折算系數換算，HQJZ的給藥劑量為9.27 g·kg-1。

1.4 儀器CM1900冷凍切片機(德國Leica公司)；KD-BM II電腦生物組織包埋機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)；YD-A生物組織攤片機(浙江省金華市益迪醫療設備有限公司)；Moticam Pro 205A三目生物顯微鏡(麥克奧迪醫療診斷系統有限公司)；Cytation 5酶標儀(美國BioTek公司)；SmartSpecTMplus核酸蛋白測定儀、MyCyclerTMPCR儀(美國Bio-Rad公司)；LightCycler 480II熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)。

2 方法

2.1 動物模型建立及分組采用隨機數字表法，將SD大鼠分為正常組、模型組、埃索美拉唑(esomeprazole, ESO)組、HQJZ組，每組各12只。參照文獻方法構建脾胃虛寒證候模型[5]，預先制備實驗所需的1 g·mL-1的番瀉葉水煎劑。正常組大鼠在造模全過程每天以10 mL·kg-1灌胃蒸餾水，不作其它任何處理。造模d 1起，模型組、ESO組、HQJZ組大鼠于下午14 ∶00以10 mL·kg-1番瀉葉水煎劑灌胃；15 ∶30左右將大鼠置于0.80 m(長)×0.59 m(寬)×0.48 m(高)規格，裝滿常溫自來水的水槽中游泳，直至大鼠四肢劃動無力，鼻唇部沒入水中，立即撈起。每天于同一時間，連續7 d采用“苦寒瀉下+勞倦過度”方法造模，由此建立脾胃虛寒證候模型。d 8起，停止脾胃虛寒證候造模，模型組在上午10 ∶00予以無水乙醇5 mL·kg-1灌胃，12 ∶00給予200 mg·kg-1的阿司匹林水溶液灌胃，由此建立DU(脾胃虛寒證)模型，連續造模4 d。ESO組、HQJZ組則在造模給藥的基礎上，每日下午14 ∶00分別給予4.17 mg·kg-1的ESO和9.27 g·kg-1的HQJZ水煎劑進行治療，連續給藥4 d(Fig 1)。

2.2 標本采集末次給藥后，所有大鼠禁食禁水12 h，d 12取材。采用3%～4%異氟烷(于100% O2環境)麻醉大鼠，常規消毒后，自胸骨劍突下沿腹中線剪開腹壁，腹主動脈采血，4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min，分離大鼠血清，-20 ℃保存備用。取血完畢后，迅速采集十二指腸標本，剪取幽門下十二指腸組織3 cm，沿腸系膜縱軸方向剖開，以冰生理鹽水漂洗干凈，相機拍照，用于觀察黏膜損傷情況，并計算黏膜損傷指數。截取1段1 cm靠近幽門的腸組織，以4%多聚甲醛固定。剩余腸組織-80 ℃保存，用于熒光定量PCR實驗。

2.3 大鼠一般癥狀與體征觀測實驗全程對比觀察各組大鼠的整體精神狀態、活動狀況、毛發光澤、食欲情況、糞便性狀等，隔天測定1次大鼠的體質量、進食量及肛溫。

2.4 十二指腸黏膜潰瘍指數(ulcer index, UI)測定肉眼觀察黏膜損傷情況，參照Guth等[6]標準進行評分。正常黏膜：0分；病灶長度≤1 mm：1分；1 mm<病灶長度≤2 mm：2分；2 mm<病灶長度≤3 mm：3分；3 mm<病灶長度≤4 mm：4分；病灶長度>4 mm時，分段計分，若病灶寬度>2 mm，則分數乘以2。最后以各組大鼠十二指腸黏膜病灶分數的均值作為UI。潰瘍愈合率/%=[(模型組UI-藥物組UI)/模型組UI]×100%。

2.5 十二指腸黏膜組織病理學檢查取出固定好的十二指腸組織，采用梯度乙醇脫水2 h，二甲苯透明，包埋。連續石蠟切片，厚度為5 μm，烤片，常規蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色，中性樹膠封片，于100倍鏡下進行組織形態觀察，選取典型視野拍照，使用ImageJ圖像分析軟件，測量小腸絨毛高度和隱窩深度。

2.6 細胞因子IL-4、IL-10和TNF-α的檢測按照試劑盒說明書準備樣品，配制溶液，混勻后，立即采用酶標儀在450 nm波長下檢測吸光度。以吸光度值(OD)為縱坐標，各細胞因子標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，樣品血清所含的細胞因子濃度根據標準曲線換算。每組設3個復孔。

2.7 熒光定量PCR法檢測TLR-2、MyD88 mRNA表達取100 mg十二指腸組織，以液氮初步碾碎后，加入1 mL TRIzol提取總RNA。運用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。采用SG Fast qPCR Master Mix試劑進行熒光定量PCR反應，引物序列見Tab 1，配制50 μL反應體系。預變性條件為：95 ℃ 30 s，1個循環。PCR反應條件為：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。65 ℃ 15 s擴增曲線分析，收集熒光信號。采用2-△△CT法計算目的基因的mRNA相對表達量，其中△Ct值=目的基因Ct值-β-actin Ct值[5]。

Tab 1 Gene primer sequences for qRT-PCR

2.8 免疫組化法檢測TLR-2、MyD88蛋白表達將固定好的十二指腸組織包埋、切片，采用二甲苯、梯度乙醇、蒸餾水分別將切片脫蠟、水化。以PBS浸潤石蠟切片，微波修復，雙氧水浸潤，PBS浸洗。滴加封閉液，室溫放置15 min，分別滴加50 μL TLR-2一抗(1 ∶100)、MyD88一抗(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜。加入山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)，室溫孵育2 h。加入DAB試劑顯色反應10 min，蘇木精溶液復染1 min。采用梯度乙醇和二甲苯脫水、透明。中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察石蠟切片，采用Motic Image 3.2軟件選取典型視野進行拍攝，應用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖片中陽性蛋白表達進行分析，以積分光密度(integral optical density, IOD)值表示[7]。

3 結果

3.1 HQJZ對大鼠體質量、進食量及肛溫的影響Fig 2結果顯示，造模前(d 0)各組大鼠的體質量、進食量、肛溫均無明顯差異。經過7 d脾胃虛寒證造模，模型(Model)組大鼠體質量、進食量、肛溫均呈現降低趨勢，再經過4 d的DU造模，模型大鼠體質量、進食量、肛溫值進一步下降(P<0.05，P<0.01)。給予HQJZ治療后，大鼠體質量明顯增加，明顯高于給藥前(d 7)、模型組(P<0.05)；大鼠進食量明顯增加，與給藥前(d 7)相比有增加趨勢，與模型組相比，差異有顯著性(P<0.05)；大鼠肛溫明顯提高，明顯高于與給藥前、模型組(P<0.01)。

3.2 HQJZ對大鼠DU的治療作用Fig 3、Tab 2結果顯示，模型組大鼠十二指腸黏膜出現嚴重損傷，可見明顯出血點或出血條帶，潰瘍指數明顯高于正常組(P<0.01)。給予HQJZ治療后，黏膜損傷明顯減輕(P<0.01)。給予HQJZ治療后，潰瘍愈合率(或抑制率)達80.53%。

Tab 2 Therapeutic effect of HQJZon duodenal ulcer in

**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel

3.3 HQJZ對大鼠十二指腸黏膜形態改變的影響Fig 4結果顯示，正常大鼠十二指腸組織黏膜層、黏膜下層、肌層層次分明，小腸絨毛排列整齊，中央乳糜管清晰可見。模型組大鼠十二指腸組織可見明顯損傷，小腸絨毛大量脫落，上皮層和固有層層次不清，中央乳糜管受損嚴重，黏膜下層可見炎性細胞浸潤。給予HQJZ治療后，大鼠十二指腸組織基本恢復正常，僅見少量的黏膜上皮細胞損傷脫落，小腸絨毛排列整齊，中央乳糜管排列規整，黏膜下層炎性細胞少見。Fig 5結果表明，模型組大鼠小腸絨毛高度明顯降低，隱窩深度變淺(P<0.01)。給予HQJZ治療后，大鼠小腸絨毛高度明顯增加，隱窩深度亦明顯增加(P<0.01)。

Fig 2 Effect of HQJZ on changes of body weight(A),food intake(B), and rectal temperature(C) in

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsd 0;△P<0.05,△△P<0.01vsd 7

Fig 3 Representative pictures of duodenal tissue in each group

A:Normal;B:Model;C:Esomeprazole;D:HQJZ.Arrowheads indicate mucosal damage/ulcer.

Fig 4 HE staining of duodenum in each group(×100)

A:Normal; B: Model; C: Esomeprazole; D: HQJZ. Arrowheads indicate severe loss of villi in the duodenum, asterisk indicates inflammatory cell infiltration.

Fig 5 Effect of HQJZ on duodenum

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group

3.4 HQJZ對大鼠血清IL-4、IL-10、TNF-α含量的影響如Fig 6所示，與正常組相比，模型組大鼠血清抗炎細胞因子IL-4、IL-10含量明顯降低(P<0.01)；給予HQJZ治療后，大鼠血清IL-4、IL-10含量均明顯增加(P<0.01)。與正常組比較，模型組大鼠血清炎性細胞因子TNF-α含量急劇增加(P<0.01)；給予HQJZ治療后，TNF-α含量明顯降低(P<0.01)。

Fig 6 Effect of HQJZ on serum cytokines in

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group

3.5 HQJZ對大鼠十二指腸黏膜TLR-2、MyD88 mRNA表達的影響Fig 7結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠十二指腸黏膜TLR-2、MyD88 mRNA表達均明顯上調(P<0.01)。給予HQJZ治療后，大鼠十二指腸黏膜TLR-2及MyD88 mRNA表達均明顯下調(P<0.01)。

Fig 7 Effect of HQJZ on expression of TLR-2 andMyD88 mRNA in duodenal mucosa of

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group

3.6 HQJZ對大鼠十二指腸黏膜TLR-2、MyD88蛋白表達的影響Fig 8結果表明，TLR-2與MyD88蛋白陽性表達部位主要分布于十二指腸黏膜。正常組大鼠腸黏膜TLR-2、MyD88蛋白表達較低，DU模型大鼠腸黏膜TLR-2和MyD88蛋白表達明顯升高(P<0.01)；給予HQJZ治療后，TLR-2及MyD88蛋白表達均明顯下調(P<0.01)。

4 討論

腸道是人體消化系統的重要組成部分，腸黏膜屏障對于維持腸道消化、吸收功能具有極其重要的作用，腸黏膜屏障損傷是DU、潰瘍性結腸炎等疾病發生、發展的重要環節[8]。腸黏膜免疫屏障主要由非特異免疫屏障(機械屏障、化學屏障、生物屏障)和免疫屏障構成[9]。與機體整體免疫系統不同，腸黏膜免疫屏障是在抗原刺激性產生的局部免疫反應，通過中和抗原物質，避免黏膜受到損害，從而防止潰瘍的發生。腸黏膜免疫屏障主要由分泌型免疫球蛋白(sIgA)介導的體液免疫和細胞毒性介導的細胞免疫構成[10]。

Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)是表達于天然免疫細胞(巨噬細胞、樹突狀細胞等)和其他細胞或組織(上皮細胞、內皮細胞等)表面最重要的模式識別受體，TLR是架接腸道固有免疫和適應性免疫的橋梁。TLR屬于I型跨膜蛋白，由富含亮氨酸重復序列的胞外區、跨膜區和含有Toll/白細胞介素1受體同源區(Toll/interleukin 1 receptor homologous region, TIR)結構域的胞內區組成，通過識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)或機體釋放的有害內源性物質，誘發天然免疫反應，抵抗病原體感染，抑制炎癥反應發生，保護組織黏膜免受損傷[11]。MyD88是胞內含有TIR結構域的蛋白分子，是激活潰瘍發生、發展過程中炎癥反應最常見的接頭分子，MyD88依賴性途徑是除TLR-3以外，其他所有TLR共同的信號通路[12]。胃腸道微生物或內源性毒素可通過刺激TLR，誘導上皮細胞遷移、增殖、分化，加固胃腸黏膜上皮緊密連接功能，保護胃腸黏膜屏障，抑制潰瘍產生。

TLR-2介導的腸黏膜免疫屏障可產生多種細胞因子，如生長因子、淋巴因子、腫瘤壞死因子、干擾素、白細胞介素等[13]。IL-2、TNF-α、IFN-γ是常見的高表達的炎性細胞因子，IL-4、IL-5、IL-10則是當前研究較多的抗炎細胞因子。TNF-α主要來源于巨噬細胞，通過與相應的介質受體結合或與其他細胞因子相互作用，引起腸黏膜上皮細胞凋亡，細胞因子瀑布式釋放，誘導黏膜損傷，促進潰瘍形成。IL-4由T細胞輔助細胞2(Th2)產生，對sIgA介導的腸黏膜屏障體液免疫具有明顯增強作用。作為一種免疫調節性細胞因子，IL-10可調節多種免疫細胞的分化和增殖，限制和終止炎癥反應，防止過度免疫應答，并在一定程度上影響緊密連接蛋白表達，保證腸黏膜上皮完整性，抑制潰瘍發生[14]。

現代藥理學研究表明，HQJZ可抑制胃酸分泌、緩解胃腸平滑肌痙攣，且具有促使肉芽生長、抗炎和抑制幽門螺桿菌的作用，可從根本上改善胃腸道的內環境，提高潰瘍愈合率[15]。本研究以TLR-2介導的腸黏膜免疫功能為切入點，探討HQJZ治療DU的藥理效應及分子機制。本研究結果表明，HQJZ可明顯改善大鼠的一般癥狀、體征，給予HQJZ治療后，模型組大鼠的體質量、進食量、肛溫均明顯提升。HQJZ可明顯促進大鼠十二指腸潰瘍愈合，潰瘍愈合率高達80.53%。HE染色結果表明，給予HQJZ治療后，DU模型大鼠十二指腸黏膜排列整齊，少見炎性細胞浸潤，結構基本恢復正常。ELISA結果表明，HQJZ可明顯增加大鼠血清抗炎細胞因子IL-4、IL-10含量，且可明顯降低致炎細胞因子TNF-α含量。分子水平實驗結果證實，HQJZ可明顯下調大鼠十二指腸黏膜TLR-2、MyD88 mRNA表達；免疫組化結果則表明，HQJZ可明顯降低DU大鼠腸黏膜TLR-2和MyD88蛋白表達。

綜上所述，本文研究結果提示，HQJZ具有明顯的促進DU愈合的效應，其機制可能與干預TLR-2介導的腸黏膜免疫屏障功能有關。