IL-1、TNF-α在免疫性肝損傷過程中對代謝酶CYP2E1的調(diào)控作用

王 濤，林 琴，劉鳳婷，李曉霞，薛永志

(包頭醫(yī)學(xué)院藥物代謝與肝臟分子藥理研究所，藥理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

感染和炎癥過程中誘發(fā)炎性細胞因子白細胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)高表達，介導(dǎo)細胞色素P450(cytochrome P450， CYP450)的下調(diào)[1]。炎癥細胞因子在全身或局部炎癥后，由多種細胞產(chǎn)生，包括單核細胞、巨噬細胞、Kupffer細胞和內(nèi)皮細胞。卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin， BCG)免疫性肝損傷過程中亦可刺激單核細胞和Kupffer細胞產(chǎn)生大量TNF-α和IL-1β。此外，TNF-α抗體消除Kupffer細胞可有效減少體內(nèi)肝損傷，提示Kupffer細胞分泌的TNF-α可能在肝損傷中起主要作用[2]。本課題組以往的研究主要集中在免疫性肝損傷過程中，NF-κB被誘導(dǎo)并產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用，抑制NF-κB的激活，可以阻止NF-κB向核內(nèi)移位，減少下游細胞因子的表達[3]。而在免疫性肝損傷過程中，NF-κB活化后IL-1β、TNF-α高表達與代謝酶CYP2E1的代謝活力、蛋白表達之間的關(guān)系尚不清楚。本研究在以往研究基礎(chǔ)上，探討細胞因子IL-1β、TNF-α在免疫性肝損傷過程中對代謝酶CYP2E1下調(diào)的作用機制，為免疫介導(dǎo)的肝損傷的藥物治療提供新的靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑清潔級♂ SD大鼠，內(nèi)蒙古大學(xué)動物實驗中心提供，體質(zhì)量(220±20)g，動物許可證號：SCXK(蒙)2005-0001。BCG凍干粉(每支60 mg，1 g·L-1)，購自中國食品藥品檢定研究院，批號：2013-01；氯唑沙宗標(biāo)準(zhǔn)品(批號：100364-201302)，中國食品藥品檢定研究院；氯唑沙宗對照品(批號：L1B0Q15)，北京百靈威科技有限公司；NF-κB的特異性抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸(ammonium pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)(批號：851002)，美國Sigma公司；乙酸乙酯(色譜純，批號：20180301)、無水甲醇(分析純，批號：20150503)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鈉(批號：20140417)，天津市北辰驊躍化學(xué)試劑廠；超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物(批號：13D17B70)，BCA蛋白定量試劑盒(批號：12C17B46)，購自博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器Water2998高效液相色譜儀(美國Waters公司；TGL-16C離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；AUW120D分析天平(島津企業(yè)管理有限公司)；Multiskan FC酶標(biāo)儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)；DYY-6D電泳儀電源(北京六一生物科技有限公司)；OmegaLum C凝膠成像儀(環(huán)亞生物科技)。

1.3 動物分組及免疫性肝損傷模型的制備SD大鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，隨機分為5組，分別為Control、BCG、BCG+PDTC低、中、高劑量組(25、50、100 mg·kg-1)，每組10只。除Control組外，其他4組尾靜脈注射BCG(125 mg·kg-1)制備免疫性肝損傷大鼠模型，Control組尾靜脈注射等體積生理鹽水。用工具藥PDTC分別對BCG+PDTC低、中、高劑量組進行干預(yù)(d 11、12、13的16時各注射1次，低、中、高劑量分別為25、50、100 mg·kg-1)。d 14眼眶靜脈叢取血，用于HPLC法測定CYP2E1代謝活性實驗，隨后將大鼠斷頭處死，迅速剖取肝臟，稱重。稱取部分肝臟組織用于ELISA及蛋白定量檢測；另稱取部分肝臟組織凍存，用于Western blot檢測。

1.4 HPLC法測定CYP2E1代謝活性將5組大鼠單次靜脈注射氯唑沙宗20 mg·kg-1，分別于給藥后5、10、20、30、60、90、120、240 min，從眼內(nèi)眥靜脈叢取血20滴(約1 mL)于肝素化試管中，3500 r·min-1離心10 min，取血漿，保存在-20 ℃的冰箱待測[4]。根據(jù)文獻方法[5]，測定血漿中CYP2E1探針?biāo)幬锫冗蛏匙跐舛鹊难帩舛冉?jīng)時變化。用藥物代謝動力學(xué)軟件DAS 3.0對血藥濃度數(shù)據(jù)進行擬合，得出AUC、Cmax、t1/2、Ke、V、CL等各項藥代動力學(xué)參數(shù)。通過測定血漿中探針?biāo)幬锫冗蛏匙谒?時曲線及藥代動力學(xué)參數(shù)的變化，檢測CYP2E1代謝活性。色譜條件:采用Waters C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm, 5 μm ), 序號為201763619313813，柱溫37 ℃。色譜工作站：Breeze2；檢測波長：287 nm。流動相：甲醇 ∶0.001%磷酸二氫鈉(70 ∶30，V/V)，流速：1 mL·min-1，進樣量25 μL，pH 5.0[4]。

1.5 ELISA法檢測大鼠肝臟IL-1β、TNF-α水平將預(yù)先提取的蛋白稀釋到合適濃度，與預(yù)先配好的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到酶標(biāo)板中，并增加一孔作為TMB空白顯色孔，其余樣本放入-80 ℃冰箱保存。用酶標(biāo)儀在450 nm測定IL-1β、TNF-α的水平。

1.6 Western blot檢測肝組織CYP2E1表達取大鼠肝臟，精確稱取0.1 g，IP細胞裂解液提取組織總蛋白。BCA法蛋白定量，在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗及二抗，顯影。

2 結(jié)果

2.1 BCG誘導(dǎo)的免疫性肝損傷大鼠肝臟病理組織學(xué)的變化如Fig 1所示，大鼠注射BCG 14 d后，光鏡下觀察到肝實質(zhì)及匯管區(qū)周圍有大量單核細胞及淋巴細胞浸潤，形成大小不等且彌漫性分布的大量肉芽腫團塊，為特征的免疫性肝損傷；給予PDTC進行干預(yù)，可見炎性細胞浸潤情況有所減輕。

2.2 PDTC對免疫性肝損傷大鼠肝臟CYP2E1代謝活力的影響大鼠注射BCG 14 d后，HPLC法測定各組大鼠血藥濃度經(jīng)時變化。如Fig 2所示，BCG組各個時間點血藥濃度均高于Control組，在給予工具藥PDTC干預(yù)后，BCG+PDTC組在20、90 min時間點的血藥濃度低于BCG組(P<0.01)。經(jīng)DAS 3.0藥代動力學(xué)軟件計算各組藥代動力學(xué)參數(shù)，Tab 1結(jié)果顯示，BCG組Ke、CL均小于Control組，V、Cmax、AUC、t1/2均高于Control組(P<0.05)。BCG+PDTC組Ke、CL高于BCG組，Cmax、AUC均低于BCG組(P<0.05)。

Fig 1 Pathological featuresin liver(HE×200)

A: Control group; B: BCG group; C：BCG+PDTC (25 mg·kg-1) ; D：BCG+PDTC (50 mg·kg-1); E：BCG+PDTC (100 mg·kg-1).

Fig 2 Plasma chlorzoxazone levels in all groups n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsBCG group

Tab 1 Plasma chlorzoxazone pharmacokinetic levels in all groups

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsBCG

2.3 PDTC對免疫性肝損傷大鼠肝臟CYP2E1表達的影響Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，內(nèi)參GAPDH各條帶密度均一，提示蛋白定量基本準(zhǔn)確，各組蛋白上樣量基本一致。Control組肝臟組織中有CYP2E1的基礎(chǔ)表達，BCG組中CYP2E1表達明顯減少(P<0.05)，給予PDTC干預(yù)，隨著劑量的增加，CYP2E1表達逐漸恢復(fù)。

Fig 3 CYP2E1 expression in all groups n=6)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsBCG group

2.4 PDTC對免疫性肝損傷大鼠肝臟IL-1β、TNF-α水平的影響如Fig 4所示，大鼠注射BCG 14 d后，肝臟組織中IL-1β、TNF-α含量增加(P<0.05)，給予工具藥PDTC干預(yù)后，隨著PDTC劑量的增大，大鼠肝臟組織中TNF-α、IL-1β含量逐漸降低。

2.5 CYP2E1與炎性細胞因子IL-1β、TNF-α的相關(guān)性分析藥代動力學(xué)參數(shù)AUC與IL-1β(r=0.871，P=0.000)以及TNF-α(r=0.788，P=0.000)呈明顯正相關(guān)。CYP2E1蛋白表達與IL-1β(r=-0.222，P=0.027)呈負(fù)相關(guān)。

Fig 4 Changes of inflammatory cytokine IL-1β and TNF-α in all groups n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBCG group

3 討論

本實驗以尾靜脈注射BCG凍干粉復(fù)制大鼠免疫性肝損傷模型，由于大鼠不能感染人類的肝炎病毒[6]，轉(zhuǎn)染人類肝炎病毒的轉(zhuǎn)基因鼠由于造價昂貴，又存在著轉(zhuǎn)基因鑒定等問題，難以實現(xiàn)較大樣本量的研究。采用尾靜脈注射BCG方法造模，能夠較好地模擬人類的免疫性肝損傷。大鼠注射BCG 14 d后，觀察到肝實質(zhì)及匯管區(qū)周圍大量炎性細胞浸潤、肝脾腫大及肝功能受損[7]，根據(jù)本室以往研究表明大鼠免疫性肝損傷模型建立成功。

大鼠注射BCG 2周后，給予NF-κB的特異性抑制劑PDTC干預(yù)，根據(jù)大鼠氯唑沙宗的血藥濃度經(jīng)時變化曲線和各組大鼠的血漿氯唑沙宗藥代動力學(xué)參數(shù)，推測NF-κB的激活會使CYP2E1的代謝活力下調(diào)，鈍化NF-κB的激活可以減緩這種下調(diào)。本實驗進一步研究表明，在免疫性肝損傷過程中，BCG組CYP2E1的蛋白表達含量減少，給予NF-κB抑制劑PDTC后，可使CYP2E1蛋白表達含量逐漸恢復(fù)，推測CYP2E1蛋白表達的下調(diào)可能與NF-κB的激活有關(guān)。為了進一步驗證NF-κB的活化與肝臟組織中IL-1β、TNF-α表達的關(guān)系，本實驗還檢測了大鼠肝臟組織中的炎性細胞因子IL-1β、TNF-α，發(fā)現(xiàn)NF-κB被激活后，IL-1β、TNF-α高表達，給予工具藥PDTC干預(yù)后，肝臟組織中的炎性細胞因子恢復(fù)到與Control組相近的正常水平。推測免疫性損傷過程中，NF-κB激活，調(diào)控大量下游炎性細胞因子，參與損傷過程。而PDTC可以通過抑制NF-κB的作用，減少IL-1β、TNF-α的表達。根據(jù)相關(guān)性分析，藥代動力學(xué)參數(shù)AUC與IL-1β、TNF-α的含量呈明顯正相關(guān)，蛋白含量與IL-1β含量呈負(fù)相關(guān)，推測炎性細胞因子IL-1β、TNF-α的高表達可能使CYP2E1代謝活力和蛋白表達下調(diào)。許多先前的研究表明，IL-1、TNF-α是免疫介導(dǎo)肝炎的關(guān)鍵因素[1-2]。根據(jù)本室以往研究，NF-κB信號傳導(dǎo)途徑是經(jīng)典的炎癥信號傳導(dǎo)途徑。NF-κB調(diào)節(jié)多種基因在炎癥反應(yīng)的表達，并且可以通過大量的細胞外刺激因子激活核轉(zhuǎn)錄因子[8]。肝臟的常駐巨噬細胞Kupffer細胞產(chǎn)生TNF-α和IL-1β，NF-κB的激活引發(fā)炎性細胞因子的釋放，在免疫性肝損傷中起重要作用。NF-κB一旦受到刺激就會轉(zhuǎn)移到細胞核，并觸發(fā)促炎性介質(zhì)如TNF-α和IL-1β的釋放。通過研究我們還發(fā)現(xiàn)，IL-1β、TNF-α的高表達會使NF-κB表達增加，進而會使CYP2E1的表達下調(diào)[9]。

綜上所述，本研究推測炎性細胞因子IL-1β、TNF-α在免疫性肝損傷過程中可以激活NF-κB，使代謝酶CYP2E1代謝活力和蛋白表達下調(diào)。用NF-κB的特異性抑制劑PDTC干預(yù)后，可以鈍化NF-κB的激活，緩解下游IL-1β、TNF-α的高表達，減緩CYP2E1代謝活力和蛋白表達的下調(diào)。