隱丹參酮通過TWEAK/Fn14和TGF-β1/Smads信號通路緩解OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠氣道炎癥

王重陽，姜京植，李俊峰，朱蓮花，金 珊，金哲虎，徐 暢，延光海

(1. 延邊大學醫(yī)學院解剖學教研室，吉林 延吉 133002；2.延邊大學附屬醫(yī)院皮膚科，吉林 延吉 133000)

哮喘是一種較為常見的過敏源引起的氣道炎癥性疾病，發(fā)病初期主要由氣道炎癥細胞與其釋放的炎癥細胞因子黏附于氣道管壁，引發(fā)氣道高反應(yīng)性(airway hyper reactivity，AHR)，使氣道形成不可逆性重塑，并導(dǎo)致肺功能下降[1]。氣道炎癥與氣道重塑被認為是相互作用、相輔相成，最終導(dǎo)致了哮喘[2]。目前除激素外，尚無特效藥物可有效治療過敏性氣道炎癥。因此，研究哮喘氣道炎癥的發(fā)病機制具有十分重要的意義。

腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)因子(TNF-related weak inducer of apoptosis，TWEAK)是一種可以表達于多種細胞的Ⅱ型跨膜蛋白[3]。TWEAK通過成纖維細胞生長誘導(dǎo)因子14(fibroblast growth factor-inducible 14，F(xiàn)n14)發(fā)揮對其他細胞的調(diào)節(jié)作用，包括促進炎癥細胞的活性、調(diào)節(jié)細胞生長、血管生成。據(jù)報道，TWEAK/Fn14/NF-κB通路在哮喘氣道炎癥中發(fā)揮重要作用[4]。轉(zhuǎn)化生長因子β1 (transforming growth factor β1，TGF-β1)為TGF家族的成員，在細胞增殖、分化等過程中發(fā)揮作用[5-6]。TGF-β1依靠其下游的Smads家族轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，其中以Smad3蛋白與TGF-β家族關(guān)系最為密切，Smad3可以認為是TGF-β1的直接底物[7]。有報道指出，TGF-β1/Smads和VEGF信號通路協(xié)同參與肺部纖維化以及炎癥的調(diào)控[8]。本實驗旨在研究TWEAK/Fn14和TGF-β1/Smads信號通路交互作用對支氣管哮喘氣道炎癥的影響。

丹參是治療過敏性疾病的中藥。隱丹參酮(cryptotanshinone，CTS)作為丹參中主要的脂溶性成分，具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用。另外，Tang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CTS能夠緩解脂多糖引起的急性肺損傷；Suh等[10]報道，CTS能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的產(chǎn)生，以及人氣道平滑肌細胞的遷移。本研究旨在闡明CTS是否通過TWEAK/Fn14和TGF-β1/Smads信號通路，緩解哮喘模型小鼠氣道炎癥，為臨床尋找新的開發(fā)藥物，提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 ♀清潔級BALB/c小鼠40只，體質(zhì)量(20±2)g，購自延邊大學實驗動物中心，合格證號為SCXK(吉)2017-0003。本研究已獲得延邊大學醫(yī)學院倫理委員會的批準，整個實驗進程中遵守《實驗動物管理條例》。

1.1.2藥物與試劑 CTS，購自德國Merck Millipore公司；卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、氫氧化鋁粉、地塞米松(dexamethasone，DEX)，均購自美國Sigma公司；DAB、免疫組化試劑盒、炎癥細胞因子ELISA試劑盒，均購自北京中杉金橋公司；抗TWEAK、Fn14抗體，均購自美國Abcam公司；抗TGF-β1(貨號：3711)、Smad2/3(貨號：12747)、Smad4(貨號：38454)、β-actin (貨號：4970)抗體，均購自美國Cell Signaling公司。

1.1.3儀器 霧化器(大連醫(yī)療器械廠U219)；2135型輪轉(zhuǎn)式切片機(德國徠卡公司)；酶標儀EPOCH、細胞成像微孔板檢測系統(tǒng)(美國Beckman公司)；15K高速冷凍臺式離心機(美國Sigma公司)；Western blot轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)；TXD3細胞涂片離心機(廣州瀘瑞明儀器有限司)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組 將40只♀ BALB/c小鼠隨機分為5組，每組8只，分別為正常組(control)、OVA慢性氣道炎癥模型組(OVA)、CTS低、高劑量治療組(CTS-L、CTS-H)、地塞米松陽性對照組(DEX)。

1.2.2小鼠氣道重塑模型的制備 所有小鼠飼養(yǎng)1周，隨后d 1、7、14，正常組小鼠每只腹腔注射200 μL生理鹽水，其它4組小鼠均每只腹腔注射200 μL OVA 10 μg與氫氧化鋁1 mg的混合溶液致敏。從d 14開始，正常組和OVA組每天腹腔注射二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)200 μL，CTS-L、CTS-H組分別腹腔注射稀釋于DMSO的CTS(20、40 mg·kg-1)200 μL，地塞米松組腹腔注射地塞米松(1 mg·kg-1)200 μL。于d 21，在每日給藥1 h后，給予正常組生理鹽水霧化，給予除正常組外其它4組3% OVA 10 mL霧化吸入激發(fā)哮喘的發(fā)生，每日30 min，連續(xù)激發(fā)7 d。

1.2.3標本收集 實驗小鼠在最后一次給藥激發(fā)24 h后，采用過量乙醚吸入法，使小鼠麻醉至死，將小鼠固定后并用酒精消毒需手術(shù)部位，使用手術(shù)剪刀剪開小鼠頸部皮膚，小心剝離小鼠頸部肌肉并暴露氣管，在氣管上剪一開口置入軟管，并將1 mL冷生理鹽水緩慢注入氣管內(nèi)，在按摩小鼠肺部的同時緩慢回抽液體，將回抽的液體即肺泡灌洗液離心提純后，置-80 ℃凍存。提純后剩余的沉淀用于細胞涂片，再將小鼠雙側(cè)肺組織剝離，置4%甲醛中固定。

1.2.4支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)炎癥細胞分類及計數(shù) BALF經(jīng)高速離心后的細胞沉淀中加入生理鹽水，至600 μL，混勻后，取200 μL置入細胞涂片離心機，以1 500 r·min-1離心5 min制備細胞涂片。經(jīng)Diff-Quick染色，在光學顯微鏡下進行炎癥細胞分類及計數(shù)。

1.2.5BALF中細胞因子含量的檢測 根據(jù)ELISA試劑盒說明書的步驟，依次檢測BALF中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-13的含量。通過標準曲線計算其濃度。

1.2.6肺組織學檢查 將固定后的左肺依次進行脫水、浸蠟、包埋等步驟，并分別進行HE、PAS染色。

1.2.7免疫組織化學檢測 將切片置于60 ℃烤箱內(nèi)熔蠟，然后進行脫蠟、脫水，并置于100 ℃的抗體修復(fù)液中修復(fù)30 min，然后分別用TWEAK和TGF-β1一抗和相對應(yīng)的二抗進行孵育。DAB顯色、蘇木精復(fù)染，最后封片觀察。

1.2.8Western blot檢測 將所需檢測的蛋白裂解后，BCA試劑盒測定樣品蛋白濃度。每個泳道加等量的蛋白質(zhì)樣品分離后，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜中， 5% BSA室溫封閉2 h，并加入稀釋的一抗(TWEAK、Fn14、TGF-β1、Smad2/3、Smad4、β-actin)4 ℃過夜。洗膜，并用相應(yīng)的二抗孵育2 h。洗膜后加入ECL發(fā)光試劑，利用Amersham Imager 600采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 CTS抑制OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠各炎癥細胞的滲出如Fig 1所示，OVA組BALF中總細胞數(shù)與嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)、中性粒細胞(neutrophil，NEU)、淋巴細胞(lymphocyte，LYM)的細胞數(shù)較正常組明顯升高(P<0.05)。與OVA組相比，CTS-L組中總細胞數(shù)與EOS的細胞數(shù)均減少(P<0.05)，且CTS-H組的總細胞數(shù)與EOS、NEU、LYM均明顯減少(P<0.05)，DEX作為陽性對照組減少更為明顯(P<0.05)。而巨噬細胞(macrophage，MAC)的細胞數(shù)在各組之間無明顯差異。

Fig 1 Number of total and differential cellular

EOS：Eosinophil; NEU：Neutrophil; MAC：Macrophage; LYM：Lymphocyte.#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsOVA.

2.2 CTS抑制哮喘小鼠炎癥細胞的滲出和杯狀細胞增生Fig 2的HE染色結(jié)果顯示，OVA組較正常組炎癥細胞浸潤明顯增多，且發(fā)現(xiàn)在血管及細支氣管周圍浸潤明顯，而CTS治療組炎癥細胞的浸潤明顯減少，且CTS高劑量組較低劑量組炎癥減輕明顯，DEX組減少最明顯。相對于正常組的PAS染色，OVA組出現(xiàn)明顯的杯狀細胞增生與黏液分泌，而CTS-L與CTS-H組PAS染色以上表現(xiàn)明顯減輕。由此得出，CTS可明顯減少炎癥細胞滲出和杯狀細胞增生。

2.3 CTS抑制OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠BALF中炎癥細胞因子的釋放如Fig 3所示，經(jīng)OVA吸入后，白細胞浸潤明顯增加，BALF中的炎癥細胞因子水平明顯升高(P<0.05)。CTS和DEX治療組中，以上炎癥細胞因子水平明顯減弱。提示CTS能夠明顯降低OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠BALF中炎癥細胞因子的水平。

Fig 2 Effect of cryptonshinone on pathologic changes of lung tissues(×200)

Fig 3 Levels of IL-4, IL-5, IL-13(A) and TNF-α, IL-1β (B) quantified by

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsOVA

2.4 CTS抑制肺組織中TWEAK和Fn14蛋白的表達Fig 4A的Western blot結(jié)果顯示，OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠肺組織中TWEAK和Fn14的蛋白表達明顯高于正常組(P<0.05)，CTS-H與DEX組TWEAK、Fn14蛋白表達較OVA組明顯下降(P<0.05)，而CTS-L組雖然TWEAK蛋白較OVA組有下降的趨勢，但差異無統(tǒng)計意義，且CTS-L組Fn14蛋白較OVA組非但沒有減少，反而高于OVA組，表明CTS在一定劑量下可以抑制TWEAK和Fn14的蛋白表達。Fig 5A免疫組織化學染色可見，OVA組較正常組氣道周圍TWEAK蛋白聚集明顯，而CTS-L組與CTS-H組較OVA組TWEAK蛋白水平均有不同程度的減弱。由此可見，CTS減弱OVA誘導(dǎo)小鼠的過敏氣道炎癥可能與TWEAK/Fn14通路有關(guān)。

2.5 CTS可抑制TGF-β1和Smads的蛋白表達Fig 4B結(jié)果表明，OVA組中TGF-β1蛋白表達較正常組明顯增加(P<0.05)，CTS-L組中的TGF-β1蛋白表達與OVA組無明顯差異，但CTS-H組TGF-β1的表達卻明顯減少(P<0.05)。與正常組相比，OVA組小鼠肺組織中Smad2/3和Smad4的蛋白含量明顯升高(P<0.05)，而CTS-L組中這兩種蛋白的表達較OVA組有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義，CTS-H組中Smad2/3和Smad4蛋白的表達較OVA組明顯減少(P<0.05)。結(jié)果提示，CTS緩解過敏性哮喘小鼠氣道炎癥可能與TGF-β1/Smads通路有關(guān)。Fig 5B免疫組織化學染色可見，OVA組較正常組氣道周圍TGF-β1蛋白聚集明顯，而CTS-L組與CTS-H組較OVA組TGF-β1蛋白水平減弱。表明CTS對OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘的抑制作用可能與TGF-β1/Smads通路有關(guān)。

Fig 4 Detection of TWEAK, Fn14(A) and TGF-β1, Smads (B) protein by Western blot

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsOVA

Fig 5 Distribution of TWEAK and TGF-β1 assessed by immunohistochemical staining(×200)

3 討論

目前，全世界患過敏性疾病的人數(shù)急劇上升，其中支氣管哮喘不僅發(fā)病率高，且難以有效治愈，其最有效的治療方式仍是使用類固醇等激素類藥物。除了提倡吸煙者戒煙，體弱者多做運動，保持健康飲食等預(yù)防措施外，似乎沒有其他有效辦法[11]。因此，迫切需要更有效的治療方法來提高支氣管哮喘疾病治療的效果。CTS是一種從丹參中純化的化合物，有報道指出，CTS在體外和體內(nèi)對肺損傷均有保護作用[9，12]。本研究證實，CTS能夠明顯減輕OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠炎癥，表明CTS可能是支氣管哮喘疾病潛在的治療藥物。

本研究發(fā)現(xiàn)，OVA誘導(dǎo)的小鼠氣道灌洗液中增加了大量炎癥細胞，包括淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、肥大細胞等。同時，OVA誘導(dǎo)的小鼠BALF中促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β)、Th2細胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的水平也明顯升高，說明OVA的誘導(dǎo)能夠打破Th1與Th2的平衡，小鼠過敏性哮喘模型成功。HE染色、PAS染色結(jié)果顯示，OVA誘導(dǎo)的小鼠杯狀細胞明顯增生，向周圍分泌大量黏液，炎癥細胞浸潤，滲出明顯；CTS可明顯降低氣道灌洗液中總細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的數(shù)量。同時ELISA結(jié)果證明，CTS能夠降低OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠促炎細胞因子及Th2細胞因子的含量，且HE染色、PAS染色結(jié)果顯示，CTS可以減少OVA誘導(dǎo)的小鼠杯狀細胞增生，降低黏液分泌，緩解血管和支氣管周圍的炎癥細胞浸潤和滲出。以上結(jié)果表明，CTS對OVA誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠氣道炎癥有明顯的抑制作用。

研究發(fā)現(xiàn)，TWEAK可以在多種器官、組織、細胞上表達，但尤以炎癥細胞中TWEAK的表達最高，包括被激活的T細胞、分化的白細胞、巨噬細胞等。在正常的組織細胞中Fn14通常呈低表達狀態(tài)，卻高表達于組織損傷或慢性炎癥，這也證實了TWEAK/Fn14相互作用參與某些炎癥反應(yīng)[13]。TGF-β1同樣是氣道炎癥中的一個關(guān)鍵因素，它能夠與下游蛋白形成異聚復(fù)合體，共同調(diào)控其下游信號通路，將其協(xié)同轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄[14]。Smads蛋白家族已被證實為TGF-β1受體的關(guān)鍵底物之一，是TGF-β1受體復(fù)合物的下游信號調(diào)節(jié)蛋白，在誘導(dǎo)TGF-β1信號從細胞表面轉(zhuǎn)入到細胞核的過程中起到重要作用[15]。本研究Western blot結(jié)果表明，CTS可有效抑制TWEAK和Fn14的蛋白表達，且與OVA組相比，CTS高劑量組可明顯降低TGF-β1、Smad2/3、Smad4的蛋白表達。免疫組織化學染色結(jié)果同樣證明，CTS可以降低OVA誘導(dǎo)的小鼠肺部組織TWEAK和TGF-β1的含量。以上結(jié)果說明，CTS可能通過TWEAK/Fn14和TGF-β1/Smads雙通路來改善過敏性哮喘氣道炎癥。

綜上所述，CTS通過減少肺組織中杯狀細胞的增生、炎癥細胞浸潤和抑制炎癥細胞因子，并降低TWEAK和TGF-β1蛋白的生成，起到改善氣道炎癥的作用，且其作用機制可能與TWEAK/Fn14和TGF-β1/Smads通路密切相關(guān)。

(致謝：本實驗在吉林省過敏性疾病重點實驗室完成，感謝各位老師和同學們給予的指導(dǎo)和幫助。)