紅景天苷調控PI3K/Akt信號通路對LPS誘導的BV2小膠質細胞的抗炎作用

楊澤霖，黃 鑫，劉俊杰，唐宇恒，洪海棉，南麗紅，洪桂祝，賴文芳

(1. 福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122; 2. 福建中醫藥大學附屬人民醫院藥學部，福建 福州 350004)

紅景天(RhodiolaroseaL.)是景天科植物，生長于海拔3 500米以上的天然植物，中國藥典2015版記載紅景天的功能與主治為“益氣活血，通脈平喘，主要用于氣虛血瘀，胸痹心痛，中風偏癱，倦怠氣喘”。紅景天苷(salidroside)是紅景天的主要有效成分，具有增強記憶、改善心腦血管系統功能等多種藥理作用。課題組前期研究發現，紅景天苷能夠降低大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠腦梗死體積，改善神經功能損傷[1-6]。有研究表明[7]，激活PI3K/mTORC2/Akt信號途徑，能夠降低磷酸化IκBα的水平，從而減少NF-κB p50亞基向細胞核的轉移，抑制炎癥因子的釋放，故激活PI3K/Akt信號途徑具有抗炎的作用。因此，本文主要研究紅景天苷調控PI3K/Akt信號通路，對脂多糖(LPS)誘導的BV2小膠質細胞的抗炎作用，進而探討紅景天苷的作用機制。

1 材料

1.1 細胞株BV2小膠質細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 藥物與試劑紅景天苷(由福建中醫藥大學提供，純度≥98%)；胎牛血清(HyClone，貨號：SV 30087.02)；Akt抗體(貨號：#2920)、p-Akt抗體(貨號：#4060)、NF-κB p50抗體(貨號：#3035)，均購自Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體(碧云天生物技術有限公司，貨號：AA128)；RNeasy? Mini Kit(QIAGEN，貨號：74104)；RevertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，貨號：K1622)；TaqMan?Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，貨號：R11022)；超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物技術有限公司，貨號：P0018)；PI3K抑制劑LY294002(Sigma，貨號：L9908)。

1.3 儀器7900HT熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)；Infinite M200 Pro多功能酶標儀(TECAN)；ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(Bio-Rad)。

2 方法

2.1 細胞培養BV2小膠質細胞接種在25 cm2細胞培養瓶中，加入含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的改良型RPMI 1640培養液，置于37 ℃細胞培養箱中培養、傳代。

2.2 實驗分組與處理BV2細胞處于對數生長期，將細胞分為5組：正常對照組(Normal組)、LPS模型組(Model組)、模型+紅景天苷(1、10、100 μmol·L-1)組。待細胞長到80%后，吸出培養基，用PBS清洗1遍，加入LPS(終濃度為100 nmol·L-1)，之后給藥組立即加入相應濃度的紅景天苷，正常對照組加入相同的溶劑，細胞繼續培養48 h，收集樣品備用。

2.3 PI3K抑制劑實驗實驗分組：正常組(Normal組)、模型組(Model組)、模型+紅景天苷組(Model+Sal組)、模型+PI3K抑制劑LY294002組(Model+LY組)、模型+PI3K抑制劑LY294002+紅景天苷組(Model+LY+Sal組)。以2×108·L-1的濃度接種BV2細胞至24孔培養板中，每孔中加入不含抗生素的培養基0.5 mL，LY294002(終濃度為50 nmol·L-1)加入30 min后，加入LPS造模，同時加入紅景天苷(10 μmol·L-1)，細胞繼續培養48 h后收集樣品備用。

2.4 qPCR法檢測相關基因的表達提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，熒光定量PCR檢測各基因的表達。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，參照GenBank中大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α的引物序列，IL-6引物上游序列5′-AGACTTCACAGAGGATACCACCCAC-3′，下游序列5′-CAATCAGAATTGCCATTGCACAA-3′，PCR擴增片斷長度為129 bp；IL-1β引物上游序列5′-ACAAGGAGAGACAAGCAACGACAA-3′，下游序列5′-TTTCCATCTTCTTCTTTGGGTATTG-3′，PCR擴增片斷長度為149 bp；TNF-α引物上游序列5′-GCCACCACGCTCTTC-TGTC-3′；下游序列5′-GCTACGGGCTTGTCACTCG-3′，PCR擴增片斷長度為149 bp；GAPDH引物上游序列5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′，下游序列5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，PCR擴增片斷長度為96 bp。

2.5 Western blot檢測相關蛋白的表達提取細胞總蛋白及核蛋白，按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書配制合適濃度的分離膠。上樣，電泳至藍色帶剛好跑到凝膠底部時終止電泳。轉膜成功后，TBS洗1遍，把PVDF膜浸泡在封閉液中，置于搖床上室溫封閉2 h。封閉好的PVDF膜用TBS洗滌10 min，加入一抗Akt(1 ∶1 000)、p-Akt(1 ∶1 000)、NF-κB p50 (1 ∶800)、β-actin(1 ∶3 000)，4 ℃孵育過夜。加入二抗，搖床室溫孵育2 h。PVDF膜用TBS洗滌10 min×3次，顯影。

3 結果

3.1 紅景天苷對BV2小膠質細胞LPS損傷后IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達的影響Fig 1的qPCR結果顯示，BV2小膠質細胞經100 nmol·L-1LPS處理后，與Control組比較，Model組中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達明顯升高；經不同濃度紅景天苷處理后，IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達明顯下降，且呈濃度依賴性，100 μmol·L-1紅景天苷作用的效果最好。

Fig 1 Effect of salidroside on expression of IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA of BV2 cells after LPS-induced injury n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3.2 紅景天苷對BV2小膠質細胞LPS損傷后p-Akt、Akt、核蛋白NF-κB p50表達的影響與Control組比較，Model組中p-Akt/Akt的比值降低，核蛋白NF-κB p50蛋白表達升高；經不同濃度紅景天苷處理后，p-Akt/Akt比例升高，核蛋白NF-κB p50蛋白表達降低，且呈濃度依賴性，100 μmol·L-1紅景天苷作用的效果最好(Fig 2)。

3.3 LY294002作用后，紅景天苷對BV2小膠質細胞LPS損傷后Akt、p-Akt和核蛋白NF-κB p50表達的影響如Fig 3所示，Model+Sal組與Model組相比，p-Akt表達升高，核蛋白NF-κB p50表達降低；經PI3K抑制劑LY294002作用后，Model+LY+Sal組與Model+Sal組比較，p-Akt表達降低，核蛋白NF-κB p50表達升高，且Model+LY+Sal組與Model+LY組比較，p-Akt及核蛋白NF-κB p50表達水平差異無顯著性。結果提示，LY294002通過抑制PI3K/Akt通路，促進NF-κB p50核轉錄，同時，紅景天苷通過PI3K/Akt通路能夠抑制NF-κB p50核轉錄水平。

3.4 LY294002作用后，紅景天苷對BV2小膠質細胞LPS損傷后IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達的影響Fig 4的qPCR結果顯示，Model+Sal組與Model組相比，IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達降低；經PI3K抑制劑LY294002作用后，Model+LY+Sal組與Model+Sal組比較，IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達水平明顯升高，且Model+LY+Sal組與Model+LY組比較，IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達水平差異無顯著性。結果提示，LY294002通過抑制PI3K/Akt通路，進而抑制紅景天苷對BV2小膠質細胞IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達的作用。

Fig 2 Effect of salidroside on p-Akt, Akt(A) and nuclear NF-κB p50 (B) protein expression of BV2 cells after LPS-induced injury n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

4 討論

小膠質細胞在免疫抑制、炎癥網絡激活過程中扮演著重要角色，并且能釋放細胞因子，促進炎癥反應，炎性反應作為眾多疾病的基礎病變，與疾病的發生、發展密切相關[8]。IL-6、IL-1β和TNF-α是重要的炎癥因子，可以促進炎癥反應和組織損傷[9]。

Fig 3 Effect of PI3K inhibitor on expression of p-Akt, Akt(A) and nuclear NF-κB p50(B) protein expression in BV2 cells after LPS-induced injury n=6)

**P<0.01vsmodel;##P<0.01vsModel+Sal

Fig 4 Effect of PI3K inhibitor on expression of IL-6, IL-1β, TNF-α mRNA in BV2 cells after

**P<0.01vsmodel;#P<0.05,##P<0.01vsModel+ Sal

NF-κB信號通路在調節免疫應答、炎癥反應中起關鍵作用，與炎性因子合成分泌息息相關[10]。本實驗采用LPS誘導BV2小膠質細胞炎癥損傷模型，LPS可以誘導小膠質細胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6，促進NF-κB p50核轉錄水平，經不同濃度紅景天苷作用后，能夠抑制TNF-α、IL-1β、IL-6表達，以及NF-κB p50核轉錄水平，呈明顯的濃度依賴性。

PI3K/Akt信號轉導通路具有調控細胞遷移、增殖、存活等多種生物學功能，是體內外重要的存活途徑。目前，PI3K抑制劑包括單純PI3K抑制劑(pan-PI3K inhibitors)和選擇性PI3K抑制劑(selective PI3K inhibitors)兩種。本實驗采用廣泛應用的LY294002進行研究，LY294002是一種分子質量為307.34的化合物，屬于單純PI3K抑制劑，可同時抑制PI3K p110α、PI3K p110β和PI3K p110δ三個亞型，使下游多條信號通路失活，已廣泛用于腦缺血/再灌注損傷機制研究。本實驗進一步探討紅景天苷對BV2小膠質細胞的抗炎作用機制。研究發現，紅景天苷能夠促進Akt的磷酸化，經PI3K抑制劑LY294002作用后，能夠阻斷紅景天苷對核蛋白NF-κB p50及炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的作用。

綜上所述，紅景天苷通過調控PI3K/Akt信號通路，進而減輕LPS誘導的BV2小膠質細胞的炎癥反應。

(致謝：本實驗在福建中醫藥大學生物醫藥研發中心完成，感謝各位老師的幫助與支持！)