骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化與Wnt11的關(guān)系

李福書，朱茄慧，胡 瑩，廖云鵬，李 沁，周 婭，孫文娟，何百成

(重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶 400016)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潛能，在適當(dāng)因子誘導(dǎo)下可分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，是再生領(lǐng)域中較為理想的種子細(xì)胞。深入了解MSCs骨向分化的調(diào)控機(jī)制，有助于推動(dòng)組織工程骨發(fā)展和提高相關(guān)骨疾病的治療效果。

骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族, 在人類目前發(fā)現(xiàn)20余種BMP成員，除對骨的發(fā)育和修復(fù)有重要作用外，還參與其他生理或病理過程。BMP2和BMP7已被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于治療相關(guān)骨科疾病，如骨折和骨不連[1]。課題組前期研究表明，BMP9誘導(dǎo)MSCs骨向分化作用明顯強(qiáng)于其他BMPs成員[2]。文獻(xiàn)報(bào)道，BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化可能與成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGFs)、生長激素(growth hormone，GH)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)和維甲酸信號有關(guān)[3]，但其誘導(dǎo)MSCs骨向分化的詳細(xì)機(jī)制目前仍不清楚。

Wnt信號對細(xì)胞的增殖與分化具有重要調(diào)控作用, 該信號依據(jù)是否需要β-catenin參與介導(dǎo)，可分成經(jīng)典Wnt信號(即Wnt/β-catenin信號)和非經(jīng)典Wnt信號。文獻(xiàn)報(bào)道，Wnt信號與多種骨骼系統(tǒng)疾病有關(guān)，如骨質(zhì)疏松癥、假性膠質(zhì)瘤綜合征等。文獻(xiàn)報(bào)道，Wnt/β-catenin信號失活，會(huì)抑制成骨細(xì)胞的活性和骨吸收，并最終導(dǎo)致骨質(zhì)減少[4]。課題組前期研究表明，BMP9在誘導(dǎo)MSCs骨向分化的過程中能明顯增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號活性，抑制該信號則減弱BMP9的成骨分化誘導(dǎo)能力。然而，關(guān)于BMP9誘導(dǎo)MSCs骨向分化與非經(jīng)典Wnt通路之間的關(guān)系尚不清楚。Wnt11是一種非經(jīng)典Wnt蛋白，也參與骨骼系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控。研究表明，Wnt11可能與高骨量綜合征有關(guān)，外源性Wnt11可增強(qiáng)干細(xì)胞的成骨能力[5]。同時(shí)，Wnt11在牙髓中也有表達(dá)且能促進(jìn)成牙細(xì)胞分化[6]。目前尚不清楚BMP9誘導(dǎo)MSCs骨向分化是否與Wnt11有關(guān)，本研究主要分析BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化與Wnt11的關(guān)系，以及可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)、小鼠肌源性干細(xì)胞C2C12、小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1，均購自美國ATCC(American Type Culture Collection)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，采用含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素及0.1 g·L-1鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.1.2試劑 實(shí)驗(yàn)所用一抗，均購自Santa Cruz Biotechnology公司；COX-2的抑制劑NS-398(N194-25MG)，購自Sigma-Aldrich公司；p38 MAPK抑制劑SB203580(s1076)，購自賽力克(Selleck)，二者均采用DMSO作為溶媒；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒(C3206)，購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.1.3儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、高速低溫離心機(jī)(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；垂直電泳槽及濕式轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)。

1.2 BMP9和Wnt11重組腺病毒載體的構(gòu)建本研究所用的重組腺病毒載體采用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建。即對鼠源BMP9和Wnt11，以及綠色熒光蛋白(GFP)的編碼序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后將所獲片段克隆到穿梭載體, 線性化穿梭載體并在BJ5183/Adeasy細(xì)胞中進(jìn)行重組；最后，把重組的質(zhì)粒線性化，轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中進(jìn)行重組腺病毒包裝。所獲重組腺病毒命名為AdBMP9、AdWnt11和AdGFP，其中AdGFP作為重組腺病毒對照。

1.3 RNA提取及聚合酶鏈反應(yīng)采用TRIzol試劑提取總RNA，然后通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。將所得到的cDNA稀釋5～10倍后，作為PCR分析的模板。本實(shí)驗(yàn)所用PCR引物序列為：GAPDH上游引物5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′，下游引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′；Wnt11上游引物5′-ACCCCTACACGGACAGAGTG-3′,下游引物 5′-AGGGAAGTCCACCAAGGTCT-3′。GAPDH作為內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)將生長狀態(tài)良好的C3H10T1/2細(xì)胞種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)的處理因素。于設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)將細(xì)胞裂解，并將裂解液煮10 min變性，采用BCA法測定樣品總蛋白濃度。采用常規(guī)方法進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。最后利用化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影并采集圖像，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Fig 1 Effects of BMP9 on osteogenic differentiation in C3H10T1/2 cells

A: ALP staining results showed the effect of BMP9 on ALP activities in C3H10T1/2 cell concentration dependently; B: Western blot assay results showed the effect of BMP9 on OPN in C3H10T1/2 cells; C: Alizarin Red S staining results showed the effect of BMP9 on matrix mineralization in C3H10T1/2 cell concentration dependently.

Fig 2 Effects of BMP9 on expression of Wnt11in multipotential progenitor cells

A: Real-time PCR assay results showed the endogenous expression of Wnt11 in the available progenitor cells; B: PCR assay results showed the effect of BMP9 on Wnt11 in C3H10T1/2 cells; C:Western blot assay results showed the effect of BMP9 on Wnt11 in C3H10T1/2(24 h); D: Western blot assay results showed the effect of Wnt11 recombinant adenovirus on Wnt11 in C3H10T1/2 cells(24 h).

1.5 ALP活性測定將指數(shù)生長細(xì)胞接種到24孔板，待貼壁后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)的處理因素。分別于處理后d 5、7檢測ALP活性，具體操作按試劑盒的說明進(jìn)行。將染色結(jié)果進(jìn)行掃描或在顯微鏡下拍照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 茜素紅S染色將C3H10T1/2細(xì)胞鋪于24孔培養(yǎng)板上，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處理。于處理后d 20，使用茜素紅S染色檢測礦化情況。操作步驟簡述如下：棄培養(yǎng)基后用PBS洗3次，加入2.5%戊二醛固定20 min；棄戊二醛后，用pH 4.2的PBS洗1次，然后用茜素紅工作液孵育30 min。最后，棄染液，并用雙蒸水清洗即可。將染色結(jié)果進(jìn)行掃描或在顯微鏡下拍照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測將生長良好的細(xì)胞種于T25培養(yǎng)瓶中，貼壁后，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染2 μg報(bào)告質(zhì)粒(p12×SBE-Luc)。轉(zhuǎn)染16 h后，將細(xì)胞消化并接種到24孔板中，并分別用AdGFP、AdBMP9、AdWnt11以及AdBMP9和AdWnt11處理。24 h后，將細(xì)胞裂解并按照試劑盒說明書測定報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性。用BCA法測定蛋白濃度，并用總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 BMP9對C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化的影響ALP染色結(jié)果顯示，BMP9能明顯增加C3H10T1/2細(xì)胞中ALP的活性(Fig 1A)。Western blot分析結(jié)果顯示，BMP9能增加C3H10T1/2細(xì)胞中骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的表達(dá)水平(Fig 1B)。同時(shí)，BMP9還能在C3H10T1/2細(xì)胞中明顯誘導(dǎo)鈣鹽沉積(礦化)(Fig 1C)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BMP9具有明顯誘導(dǎo)MSCs骨向分化的潛能。

2.2 BMP9在干細(xì)胞中對Wnt11表達(dá)的影響定量PCR測定結(jié)果顯示，Wnt11在C3H10T1/2、MEFs、MC3T3-E1和C2C12等細(xì)胞中均有內(nèi)源性表達(dá)(Fig 2A)。在C3H10T1/2細(xì)胞中，BMP9可以明顯促進(jìn)Wnt11的mRNA及蛋白表達(dá)(Fig 2B、2C)。以上結(jié)果表明，BMP9在MSCs中能誘導(dǎo)Wnt11表達(dá)，提示W(wǎng)nt11可能參與調(diào)節(jié)BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化。

Fig 3 Effects of Wnt11 on osteogenic markers induced by BMP9 in C3H10T1/2 cells

A: ALP staining results showed the effect of BMP9 and/or Wnt11 on ALP activities in C3H10T1/2 cells; B: Western blot assay results showed the effect of BMP9 and/or Wnt11 on OPN in C3H10T1/2 cells; C: Alizarin Red S staining results showed the effect of BMP9 and/or Wnt11 on matrix mineralization in C3H10T1/2 cells.

2.3 Wnt11與BMP9對C3H10T1/2細(xì)胞骨向分化的影響ALP染色結(jié)果顯示，Wnt11對C3H10T1/2細(xì)胞的ALP活性沒有影響，但可明顯增加BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞ALP活性增加的作用(Fig 3A)。Western blot分析結(jié)果顯示，Wnt11對OPN的蛋白水平無明顯影響，但可增強(qiáng)BMP9在C3H10T1/2細(xì)胞中促進(jìn)OPN表達(dá)的作用(Fig 3B)。茜素紅染色結(jié)果顯示，Wnt11本身并不能在C3H10T1/2細(xì)胞中誘導(dǎo)礦化，但可促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞礦化的作用(Fig 3C)。以上結(jié)果提示，Wnt11能促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞骨向分化的作用。

2.4 Wnt11與BMP9在C3H10T1/2細(xì)胞中對BMP/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響報(bào)告質(zhì)粒分析結(jié)果顯示，BMP9增加p12xSBE-Luc報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性。雖然Wnt11對該報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性沒有明顯影響，但能明顯增強(qiáng)BMP9對該報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性的促進(jìn)作用(Fig 4A)。Western blot分析結(jié)果顯示，BMP9能促進(jìn)Smad1/5/8的磷酸化(p-Smad1/5/8)，同時(shí)也增加Smad1/5/8的總蛋白水平；Wnt11對Smad1/5/8和p-Smad1/5/8的水平均無明顯影響，但能明顯增強(qiáng)BMP9對Smad1/5/8磷酸化的促進(jìn)作用(Fig 4B～4D)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Wnt11對BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的促進(jìn)作用可能與其增強(qiáng)BMP/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

2.5 Wnt11與BMP9在C3H10T1/2細(xì)胞中對p38 MAPK信號的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，BMP9或Wnt11均能促進(jìn)p38 MAPK磷酸化(p-p38)，且Wnt11能明顯增強(qiáng)BMP9促進(jìn)p38 MAPK磷酸化的作用(Fig 5A)。Wnt11可促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞ALP活性增強(qiáng)的作用，抑制p38 MAPK能明顯減弱BMP9誘導(dǎo)ALP活性增加的作用，但Wnt11能明顯逆轉(zhuǎn)p38 MAPK抑制劑對BMP9誘導(dǎo)ALP活性的抑制作用(Fig 5B)。Western blot分析結(jié)果顯示，Wnt11增加BMP9誘導(dǎo)的OPN蛋白水平，但可被p38 MAPK的抑制劑減弱；當(dāng)與Wnt11合用時(shí)，p38 MAPK抑制劑降低BMP9誘導(dǎo)OPN蛋白表達(dá)作用可被明顯逆轉(zhuǎn)(Fig 5C)。Wnt11可以促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞礦化，p38 MAPK特異性抑制劑明顯降低BMP9誘導(dǎo)礦化的作用；但是，p38 MAPK抑制劑對BMP9誘導(dǎo)礦化的抑制作用可明顯被外源Wnt11逆轉(zhuǎn)(Fig 5D)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Wnt11對BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的促進(jìn)作用可能也與其增強(qiáng)p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

Fig 4 Effects of Wnt11 on BMPs/Smads signal induced by BMP9 in C3H10T1/2 cells

A: Luciferase reporter assay results showed that the effect of Wnt11 on the BMPs/Smads signal activity increased by BMP9 in C3H10T1/2 cells; B: Western blot assay results showed the effect of Wnt11 on Smad1/5/8 and p-Smad1/5/8 affected by BMP9 in C3H10T1/2 cells; C: Quantification of the result of Western blot assay showed the effect of Wnt11 on Smad1/5/8 affected by BMP9 in C3H10T1/2 cells; D: Quantification of the result of Western blot assay showed the effect of Wnt11 on p-Smad1/5/8 affected by BMP9 in C3H10T1/2 cells.*P<0.05,**P<0.01vsAdGFP;#P<0.05,##P<0.01vsAdBMP9 group.

3 討論

BMP9具有明顯誘導(dǎo)干細(xì)胞骨向分化的能力，但該作用的分子機(jī)制目前仍不十分清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，BMP9在MSCs中能明顯上調(diào)Wnt11表達(dá)水平，而Wnt11對BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞骨向分化的功能具有促進(jìn)作用；Wnt11促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSCs骨向分化的作用可能與增強(qiáng)BMP/Smad信號及p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

BMP9具有更強(qiáng)的成骨分化誘導(dǎo)作用，具有較好的臨床應(yīng)用前景。但迄今為止，BMP9誘導(dǎo)干細(xì)胞骨向分化的機(jī)制仍不十分清楚。Wnt信號能調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化，因而對胚胎和個(gè)體的發(fā)育具有重要影響。文獻(xiàn)報(bào)道，Wnt3a可誘導(dǎo)脂肪組織來源祖細(xì)胞的成骨分化，但它只是增加早期成骨分化[7]。Wnt/β-catenin信號可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化過程中BMP2的表達(dá)[8]。骨硬化蛋白是Wnt/β-catenin信號的內(nèi)源性抑制因子，抑制骨硬化蛋白可以增加骨量[9]。課題組前期研究表明，BMP9可以激活Wnt/β-catenin信號，沉默β-catenin可減弱BMP9誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的能力。除經(jīng)典Wnt信號外，非經(jīng)典Wnt信號對成骨分化也具有調(diào)控作用。Wnt5a是非經(jīng)典Wnt蛋白，能調(diào)節(jié)骨重建過程，并促進(jìn)MSCs的成骨分化[10-11]。Wnt11也是一種非經(jīng)典途徑的Wnt蛋白，在人類早期胚胎中，Wnt11的表達(dá)局限于發(fā)育中骨骼的軟骨膜和其他特殊區(qū)域，如肺間質(zhì)和輸尿管芽。Wnt11位于為11q13.5，提示W(wǎng)nt11可能與高骨密度有關(guān)[12]。在MSCs成骨過程中，Wnt11能被上調(diào)，且能增加成骨能力[5]，Wnt11可以調(diào)節(jié)拉伸應(yīng)力，誘導(dǎo)脂肪來源的MSCs成骨分化[13]。本研究結(jié)果顯示，BMP9能促進(jìn)Wnt11表達(dá)，過表達(dá)Wnt11能促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的能力。

Fig 5 Effects of p38 MAPK and Wnt11 on BMP9-induced osteogenic differentiation in C3H10T1/2 cells

A: Western blot assay results showed the effect of BMP9 and/or Wnt11 on p38 and p-p38 in C3H10T1/2 cells; B: ALP staining results showed the effects of BMP9,Wnt11, and/or p38 on ALP activities in C3H10T1/2 cells(SB: SB203580, p38 MAPK-specific inhibitor); C: Western blot assay results showed the effects of BMP9, Wnt11, and/or p38 on OPN in C3H10T1/2 cells(Day 11); D: Alizarin Red S staining results showed the effects of BMP9, Wnt11, and/or p38 on matrix mineralization in C3H10T1/2 cells.

BMP9可通過BMP/Smad信號發(fā)揮其生理功能。即BMP9與II型BMP受體結(jié)合，然后與I型受體形成異二聚體并激活I(lǐng)型受體。這種異二聚體促進(jìn)Smad1/5/8磷酸化，然后磷酸化的Smad1/5/8與Smad4形成復(fù)合物，并易位入核，調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)。因此，Wnt11對BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的促進(jìn)作用可能與該信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性增加有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，盡管過表達(dá)Wnt11本身對Smad1/5/8的磷酸化水平?jīng)]有明顯影響，但Wnt11可以增強(qiáng)BMP9促進(jìn)Smad1/5/8磷酸化的作用。此外，BMP9也可通過非經(jīng)典BMP/Smad信號發(fā)揮其功能，如MAPKs[14]。文獻(xiàn)報(bào)道，抑制p38 MAPK可減少Wnt11在人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)的鈣化[15]。因此，我們推測Wnt11也可能通過p38 MAPK途徑增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的成骨分化。本研究結(jié)果顯示，BMP9和Wnt11均可促進(jìn)p38 MAPK的磷酸化，抑制p38 MAPK則減弱BMP9的成骨分化誘導(dǎo)能力，但這一作用能被Wnt11明顯逆轉(zhuǎn)。提示W(wǎng)nt11促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的作用可能與增強(qiáng)p38 MAPK信號有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，BMP9在MSCs中可以上調(diào)Wnt11表達(dá)，并且Wnt11可以增強(qiáng)BMP9的成骨分化誘導(dǎo)能力，這種作用可能與Wnt11增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的BMP/Smad和p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性有關(guān)。研究結(jié)果可能有助于促進(jìn)基于BMP9的骨組織工程發(fā)展，但Wnt11調(diào)節(jié)BMP/Smad和p38 MAPK信號的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[致謝：本實(shí)驗(yàn)在重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝何通川教授(T. C. HE，芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心)饋贈(zèng)本實(shí)驗(yàn)所需的重組腺病毒載體。]