馬里苷通過(guò)AMPK通路抑制高糖軟脂酸誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥損傷的作用機(jī)制

阿米拉·阿不拉提，張楠楠，古麗拜克熱木·熱合曼，范雪梅，毛新民，姚 藍(lán)

(新疆醫(yī)科大學(xué)1. 中醫(yī)學(xué)院中藥系、2. 藥學(xué)院藥理教研室、3. 中醫(yī)學(xué)院、4. 中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

隨著人類(lèi)生活水平不斷提高，糖尿病腎病(diabetes nephropathy，DN)發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，這已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重要問(wèn)題。DN是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭最嚴(yán)重、最常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥之一[1]。研究表明，糖脂代謝紊亂會(huì)引起腎臟內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，炎癥細(xì)胞因子的增加，激活多種信號(hào)通路，誘發(fā)DN的發(fā)生、發(fā)展，加重腎臟的損害[2]。

兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)又名昆侖雪菊，在新疆民間維吾爾人當(dāng)作花茶飲用，對(duì)心血管疾病有預(yù)防作用。植物化學(xué)研究表明，兩色金雞菊富含黃酮類(lèi)化合物，其具有明顯的抗氧化、抗病毒、抗炎等活性[3]。研究發(fā)現(xiàn)，馬里苷是黃酮類(lèi)化合物的主要活性成分之一，為查爾酮主要的葡萄糖苷[4]，其具有良好的降高血糖[5]、調(diào)血脂、抗高血壓[6]等功效。課題組前期研究已證實(shí)，兩色金雞菊提取物的活性成分通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用，但其主要活性成分的藥理作用機(jī)制仍有待于研究。因此，本研究以馬里苷為研究對(duì)象，觀察其對(duì)體外DN模型中氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，以及對(duì)纖維蛋白因子表達(dá)的影響。通過(guò)腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號(hào)通路，研究馬里苷延緩模型細(xì)胞炎癥與氧化應(yīng)激損傷所致腎臟纖維化病變的作用機(jī)制，為兩色金雞菊中活性成分馬里苷的藥理作用與開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1(貨號(hào)：ZQ0540)，均購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。馬里苷(批號(hào)：171215)，購(gòu)自成都昂賽思生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司，批號(hào)：SH30022.01)；抗體NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)(14347-1-AP)、膠原蛋白VI(Collagen VI)(17023-1-AP)、AMPKα(66536-1-lg)，均購(gòu)自Proteintech公司；抗體磷酸化-AMPKα(p-AMPKα)(AF3423)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)(AF1027)，購(gòu)自Affinity Biosciences；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)抗體(Cell Signaling公司，批號(hào)：19245S)；抗體AMPKγ1(ab32508)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)(ab2413)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)(ab25124)購(gòu)自Abcam公司；MTS細(xì)胞增殖試劑盒(比色法)(Promega，批號(hào)：G3580)；

1.2 儀器Steri-CuLt型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)；AxioObserverZ1倒置顯微鏡(德國(guó)ZEISS)；5427R型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)；Multiskan GO酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher)；156-8001型垂直電泳槽、GelDocXR+凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖 用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，將細(xì)胞置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中適應(yīng)性培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，接種于96孔板中，5×103個(gè)/孔。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合70%～80%后，棄上清。將細(xì)胞分為11組，分別是：空白組(Control，無(wú)細(xì)胞只含培養(yǎng)基)，正常對(duì)照組(NG，有細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基)；高糖+軟脂酸組(HG+PA)，采用葡萄糖100 mmol·L-1、軟脂酸250 μmol·L-1干預(yù)細(xì)胞建立模型；馬里苷干預(yù)組在模型細(xì)胞建立的基礎(chǔ)上，采用不同劑量馬里苷(1、 5、 10、 20、 40、 80、 160、 320 μmol·L-1)干預(yù)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄上清，每孔加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基+MTS 20 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育2 h，酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率/%=(A藥物組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

1.3.2Western blot實(shí)驗(yàn) 在T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HBZY-1細(xì)胞，細(xì)胞融合至80%～90%后，分為NG組、HG+PA組、HG+PA+ 馬里苷(25、50、100、200 μmol·L-1)(HG+PA+M25、HG+PA+M50、HG+PA+M100、HG+PA+M200)給藥組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，冰上裂解，加入蛋白裂解液RIPA提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，在100 V、250 mA條件下冰浴轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉膜2 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，避光常溫孵育二抗2 h，顯色，測(cè)灰度值(實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次)。ImageJ軟件進(jìn)行檢測(cè)與分析條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 馬里苷對(duì)高糖軟脂酸誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞增殖的影響Tab 1結(jié)果顯示，高糖軟脂酸干預(yù)下的模型組增殖率為212.85%，明顯高于正常組(P<0.01)，說(shuō)明DN細(xì)胞模型建立成功。在此基礎(chǔ)上采用不同濃度馬里苷干預(yù)，對(duì)細(xì)胞增殖出現(xiàn)了抑制作用，其中馬里苷(80、320 μmol·L-1)組細(xì)胞增殖率明顯下降(P<0.05)。但當(dāng)馬里苷濃度達(dá)到160 μmol·L-1時(shí)，其抑制作用出現(xiàn)了反彈，原因可能是隨馬里苷給藥濃度的升高，馬里苷本身的顏色加深，隨之吸光度(OD)值也增加。

Tab 1 Effect of marein on HBZY-1 cell proliferationinduced by high glucose palmitic

#P<0.05,##P<0.01vsNG;*P<0.05,**P<0.01vsHG+PA

2.2 馬里苷對(duì)高糖軟脂酸誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞中氧化應(yīng)激因子NOX4表達(dá)的影響如Fig 1所示，與正常對(duì)照組相比，高糖軟脂酸干預(yù)后的模型細(xì)胞中NOX4蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與高糖軟脂酸模型組相比，NOX4蛋白表達(dá)量隨馬里苷濃度的增加而呈下降趨勢(shì)(P<0.01)。

2.3 馬里苷對(duì)高糖軟脂液誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞中炎性因子TGF-β1、MCP-1表達(dá)的影響如Fig 2所示，與正常對(duì)照組相比，高糖軟脂酸干預(yù)后的模型細(xì)胞中TGF-β1、MCP-1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與高糖軟脂酸模型組相比，TGF-β1、MCP-1的蛋白表達(dá)隨馬里苷濃度的增加而明顯下降(P<0.01)。

Fig 1 Effect of marein on expression of NOX4 protein in HBZY-1cells induced by high glucose and palmitic

##P<0.01vsNG group;**P<0.01vsHG+PA group

Fig 2 Effect of marein on expression ofTGF-β1 and MCP-1 protein in HBZY-1cells induced by high glucose and palmitic

##P<0.01vsNG group;**P<0.01vsHG+PA group

2.4 馬里苷對(duì)高糖軟脂酸誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞中α-SMA、FN、Collagen Ⅵ表達(dá)的影響如Fig 3所示，與正常組比較，高糖軟脂酸干預(yù)后的模型細(xì)胞中α-SMA表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P<0.01)；與高糖軟脂酸模型組比較，馬里苷(25、50、200 μmol·L-1)干預(yù)模型細(xì)胞后，α-SMA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。高糖軟脂酸干預(yù)后，模型細(xì)胞中FN、Collagen Ⅵ的蛋白表達(dá)與正常組比較明顯升高(P<0.01)；與高糖軟脂酸模型組相比，F(xiàn)N、Collagen Ⅵ的蛋白表達(dá)隨馬里苷濃度的增加而呈下降趨勢(shì)(P<0.01)，其中馬里苷200 μmol·L-1抑制模型細(xì)胞中Collagen Ⅵ表達(dá)作用最為明顯。

Fig 3 Effects of marein on expression ofα-SMA, FN, collagen Ⅵ in HBZY-1 cells induced byhigh glucose and palmitic

##P<0.01vsNG group;**P<0.01vsHG+PA group

Fig 4 Effect of marein on expression ofp-AMPKα and AMPK γ1 protein in HBZY-1cells induced by high glucose and palmitic

##P<0.01vsNG group;*P<0.05,**P<0.01vsHG+PA group

2.5 馬里苷對(duì)高糖軟脂酸誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞中AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，與正常組比較，高糖軟脂酸干預(yù)后的模型細(xì)胞中p-AMPKα、AMPKγ1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.01)；不同濃度馬里苷干預(yù)模型細(xì)胞后，一定程度上調(diào)p-AMPKα、AMPKγ1蛋白表達(dá)，其中馬里苷100、200 μmol·L-1組p-AMPKα蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組明顯增加(P<0.05)。馬里苷50、100、200 μmol·L-1能明顯增加細(xì)胞中AMPKγ1蛋白表達(dá)。

3 討論

目前DN發(fā)病機(jī)制尚不明確，腎小球系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化是DN病理早期改變，以系膜細(xì)胞增殖、基底膜的增厚、腎小球基質(zhì)聚集及腎小球硬化為特征。機(jī)體長(zhǎng)期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，是發(fā)生腎小球硬化的關(guān)鍵[7]。因此，研究認(rèn)為“氧化應(yīng)激”是DN發(fā)展和進(jìn)展的關(guān)鍵中介[8]。糖尿病過(guò)程中持續(xù)代謝紊亂誘發(fā)腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成線(xiàn)粒體以及內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、相關(guān)代謝通路異常及腎臟結(jié)構(gòu)與功能的改變[9]。在DN早期，NOX4在糖尿病腎小球中高表達(dá)[10]，產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，誘導(dǎo)腎臟發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)多種信號(hào)通路介導(dǎo)腎小球肥大、腎小球基底膜增厚、胞外基質(zhì)FN、膠原蛋白等沉積，最終導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)與功能的改變。因此，尋找NOX4抑制劑具有臨床新藥的研究意義[11]。本實(shí)驗(yàn)表明，馬里苷抑制氧化應(yīng)激損傷因子NOX4表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)腎臟損傷。

炎性因子TGF-β1是介導(dǎo)DN腎臟炎癥反應(yīng)及纖維化病變的重要誘導(dǎo)因子，在DN狀態(tài)下，TGF-β1含量異常增加，通過(guò)誘導(dǎo)其下游信號(hào)通路，刺激系膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、小管上皮細(xì)胞等增殖，并釋放大量FN、膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分。肌成纖維細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源之一，TGF-β1通過(guò)激活下游Smad2/3信號(hào)通路，誘導(dǎo)成纖維蛋白的標(biāo)志性蛋白α-SMA異常表達(dá)，激活腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化與分化，促使腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化加劇。成纖維母細(xì)胞的異常增多釋放大量纖維蛋白FN、膠原，是細(xì)胞外基質(zhì)增厚，腎小球、腎小管濾過(guò)率降低，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]。MCP-1在DN進(jìn)展中是重要的促炎細(xì)胞因子。在高糖高脂環(huán)境下，腎小球系膜細(xì)胞、足細(xì)胞等多種功能細(xì)胞，均大量釋放MCP-1到細(xì)胞外，對(duì)腎臟細(xì)胞增殖、炎性及細(xì)胞黏附性均有影響，可以在一定程度上反映腎臟受炎癥損傷的程度。高糖軟脂酸刺激系膜細(xì)胞增加MCP-1蛋白表達(dá)，加劇腎臟炎癥反應(yīng)[13]。由此可知，DN過(guò)程中伴隨炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腎臟纖維化病變的重要發(fā)病機(jī)制，馬里苷能明顯抑制高糖軟脂酸誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞中TGF-β1、MCP-1表達(dá)，進(jìn)而延緩炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的腎臟損傷。

AMPK被認(rèn)為是一種細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)介質(zhì)，并有助于系膜細(xì)胞增殖和纖維化的產(chǎn)生[14]，參與細(xì)胞能量代謝，調(diào)節(jié)機(jī)體能量的儲(chǔ)存與消耗。AMPK主要以α、β、γ三個(gè)亞基的形式存在。AMPK最重要的亞基是γ亞基, 是體內(nèi)AMPK水平傳感器。近年來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)，AMPK在腎臟高表達(dá)，參與腎臟細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)，并發(fā)揮對(duì)腎臟保護(hù)作用。激活A(yù)MPK可抑制成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積累[15]。AMPK通過(guò)抑制腎臟氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，延緩糖尿病腎病腎臟病理?yè)p傷[16]。分子對(duì)接模擬表明，馬里苷與AMPKγ亞基有高度親和力，通過(guò)作用于AMPKγ亞基，上調(diào)活性AMPK磷酸化水平。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，馬里苷通過(guò)活化AMPKγ亞基，抑制丙二醛誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜絡(luò)細(xì)胞凋亡[4]。本研究進(jìn)一步證實(shí)，馬里苷對(duì)AMPKγ1蛋白具有明顯上調(diào)作用，進(jìn)一步說(shuō)明了AMPK可能為馬里苷的活性作用靶點(diǎn)。馬里苷通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路，抑制高糖軟脂酸誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞中氧化應(yīng)激與炎癥損傷，在延緩DN的腎臟纖維化病變中發(fā)揮保護(hù)作用。然而，AMPK在腎臟中的保護(hù)作用機(jī)制較為復(fù)雜，馬里苷如何通過(guò)介導(dǎo)AMPK通路調(diào)控DN的發(fā)生、發(fā)展，仍有待于進(jìn)一步研究。