基于蛋白質組學探討粗壯女貞總苷對高脂血癥金黃地鼠的調脂作用機制

張紫文，李晨晨，潘瑞樂，孫 樂，楊潤梅，陳愛兵，高南南

[1. 河北科技大學化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018；2. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室&中藥(天然藥物)創(chuàng)新藥物研發(fā)北京市重點實驗室，北京 100193]

大量研究資料表明，高脂血癥是腦卒中、冠心病、心肌梗死、心臟猝死等心腦血管疾病獨立而重要的危險因素，因此，調節(jié)血脂、改善血脂異常的臨床治療是降低心腦血管病發(fā)生率和死亡率的重要措施[1]。目前，臨床上廣泛使用的降脂西藥主要是他汀類、貝特類，它們的降脂療效確切，但長期使用都存在不可避免的副作用。相對于西藥來說，降脂中藥歷史悠久，具有品種多、毒副作用小的優(yōu)點。近年來的研究表明，很多中藥都有調節(jié)血脂的作用，如大黃、山楂、黃連、三七、蒲黃、黨參、何首烏、葛根、萊菔子等，同時也發(fā)現(xiàn)了姜黃素、小檗堿、金絲桃苷等一些降脂作用較強的活性成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，源于小葉苦丁茶基源植物的粗壯女貞總苷[total phenylpropanoid glycoside fromLigustrumrobustum(Roxb.) Blume，LRTPG]具有很好的調節(jié)血脂和肝脂作用。進一步機制研究表明，LRTPG能促進地鼠肝激酶B1(liver kinase B1，LKB1)磷酸化，激活腺苷酸(AMP)活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，進而磷酸化抑制固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein 1c，SREBP-1c)，在轉錄水平抑制其下游的脂肪酸和甘油三酯(triglyceride，TG)合成酶的表達[2-3]。課題組還發(fā)現(xiàn)，LRTPG可以使高脂飼料誘導的肥胖小鼠體質量、脂肪量、脂肪細胞橫截面面積、Lee’s指數(shù)和總膽固醇(total cholesterol，TC)水平下降。其減肥調脂機制為脂肪組織的瘦素水平升高，并因此降低脂肪組織的甘油二酯酰基轉移酶水平，從而抑制TG的合成；同時，肝臟膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1)的表達增加，促進了膽固醇的分解代謝[4]。中藥有效部位的調脂作用通常有多個靶點和多條途徑，為了尋找LRTPG除了LKB1-AMPK- SREBP-1c及CYP7A1以外的其他調脂通路，本實驗擬通過label-free蛋白質組學技術，應用前期實驗的高脂血癥模型組和LRTPG給藥組金黃地鼠肝臟[2]，進一步探究LRTPG的調脂機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源 高脂飼料誘導建立的金黃地鼠高脂血癥模型組肝臟，分別標記為M1、M2、M3；LRTPG(1.2 g·kg-1，連續(xù)灌胃給藥4周)給藥組肝臟分別標記為L1、L2、L3。

1.1.2試劑與儀器 FA、HPLC級氨水、ACN(美國Sigma公司)；蛋白裂解液(瑞士Roche公司)；BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀生物技術有限公司)。高速離心機、熱干濃縮儀、pH計、質譜、液相、NanoDrop(美國Thermo Scientific公司)；酶標儀(美國BioTek公司)。

1.2 方法研缽中加入蛋白裂解液，充分研磨肝臟樣品，冰上超聲破碎后取上清，采用微孔檢測法測定蛋白濃度，將SDS-PAGE上樣緩沖液與各組蛋白樣品按照1 ∶4的比例混勻，沸水浴5 min，冷卻到室溫后，離心取上清，加入加樣孔后進行電泳。蛋白定量后，用50 mmol·L-1碳酸氫銨稀釋至蛋白中尿素濃度為2 mol·L-1，按100 ∶1加入胰蛋白酶，37 ℃酶解超過12 h。采用納升液相色譜分離樣品，水相(A相)為0.1%甲酸水溶液，有機相(B相)為0.1%甲酸和80%乙腈水溶液，流速為600 nL·min-1。樣品經(jīng)液相系統(tǒng)分離后，用質譜儀進行質譜分析。使用Mascot 2.2軟件進行查庫鑒定，并利用Proteome Discoverer 1.4定量分析，數(shù)據(jù)庫為uniprot-mouse-160125，過濾參數(shù)為Peptide FDR≤0.01。

2 結果

2.1 金黃地鼠肝臟總蛋白的提取分析與SDS-PAGE電泳金黃地鼠肝臟通過提取、裂解及定量，測出蛋白提取率及濃度均符合下一步測試要求。通過SDS-PAGE對提取結果進行檢測發(fā)現(xiàn)，6組樣品之間平行度較好，蛋白條帶清晰(Fig 1)。

Fig 1 SDS-PAGE gel map of liver sample

2.2 生物信息分析對實驗中得到的549個差異蛋白進行GO分析和KEGG Pathway分析。GO分析目的為研究差異蛋白的功能，生物過程(biological process，BP)分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要涉及代謝過程、運輸過程、氧化還原過程、蛋白質運輸過程、磷酸化、信號轉導、細胞內蛋白質轉運、蛋白水解和脂質代謝過程。其中，參與代謝過程的蛋白最多，為56個蛋白，占10%；參與運輸過程和氧化還原過程的蛋白分別為54和43個，各占9.8%和7.8%；參與脂質代謝過程的蛋白為12個，占2.2 %(Fig 2)。細胞位置(cell component，CC)分析表明，差異蛋白所處位置主要為細胞質，占42.4 %(Fig 3)。分子功能(molecular function，MF)分析鑒定揭示出差異蛋白涉及多項分子功能，包括蛋白質結合(19.7%)、核苷酸結合(15.5%)、金屬離子結合(12%)、poly(A)RNA結合(11.1%)、水解酶活性(8.7%)和脂質結合(1.8%)等功能(Fig 4)。通過KEGG pathway對549個差異蛋白進行檢索，這些蛋白共參與到30個信號轉導通路中，涉及多種代謝途徑，包括氧化磷酸化、非酒精性脂肪肝病、PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路、cGMP-PKG信號通路等(Fig 5)。

Fig 2 Biological progress

2.3 樣本表達模式聚類聚類分析根據(jù)數(shù)據(jù)的數(shù)學特征對數(shù)據(jù)進行分類比較，本實驗對差異表達蛋白在模型組和LRTPG(1.2 g·kg-1)給藥組間比較，分析蛋白的上調和下調情況。L組代表LRTPG給藥組，M組代表模型組，其中蛋白上調用紅色表示，蛋白下調用綠色表示，差異蛋白聚類圖見Fig 6。

Fig 3 Cellular component

Fig 4 Molecular function

Fig 5 KEGG annotation of differential proteins

Fig 6 Clustering map of differential protein in Lgroup and M group

2.4 差異表達蛋白篩選結果采用Proteome Discoverer 1.4對蛋白質組進行Label-free定量分析，結果表明，共鑒定出2 231個蛋白，模型組與LRTPG給藥組差異表達蛋白為549個，其中93種蛋白表達上調，59種蛋白表達下調，397種蛋白只在模型組或者給藥組中有定量值。以兩組樣本定量比值(fold change，F(xiàn)C)求取log10對數(shù)為橫坐標，以T檢驗顯著性檢驗P值的負對數(shù)-log10(P-value)為縱坐標，得到火山圖，見Fig 7。火山圖中的綠色和紅色圓點表示差異具有顯著性的蛋白質(滿足FC≤0.667或FC≥1.5)，灰色圓點為無變化的蛋白質(0.667

Fig 7 Volcanic map of protein abundance

我們進一步以FC> 3或FC< 0.4為篩選條件，篩選出21個差異顯著性表達的蛋白，利用Uniport數(shù)據(jù)庫分析這些蛋白質的生物學過程及分子功能。Tab 1結果顯示，其中參與代謝過程的蛋白有8個，LRTPG作用后表達明顯上調的蛋白有7個：砷甲基轉移酶(arsenite methyltransferase，As3mt)參與毒素代謝過程；羧肽酶Q(carboxypeptidase Q，CPQ)在循環(huán)肽的水解中起重要作用；高溫相關絲氨酸蛋白酶A2(high temperature requirement protein A2，Htra2)在細胞凋亡過程中起到促進蛋白降解的作用；神經(jīng)溶解素(neurolysin，Nln)可以水解寡肽；線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(mitochondrial NAD kinase 2，Nadk2)參與煙酰胺代謝；吲哚乙胺N-甲基轉移酶(indolethylamine N-methyltransferase，Inmt)參與色氨酸代謝；視黃醇脫氫酶10(retinol dehydrogenase 10，Rdh10)是正常胚胎發(fā)育所必需的。表達明顯下調的蛋白有1個：S-腺苷高半胱氨酸水解酶樣蛋白2(S-adenosylhomocysteine hydrolase-like protein 2，Ahcyl2 )參與半胱氨酸和蛋氨酸代謝。

參與蛋白質運輸、修飾、結合以及合成過程的蛋白有8個，表達明顯上調的蛋白有3個：過氧化物酶體膜蛋白14(peroxisomal membrane protein PEX14，Pex14)在過氧化物酶體轉運中發(fā)揮關鍵作用；線粒體外膜導入復合蛋白2(metaxin-2，Mtx2)參與蛋白質轉運到線粒體中；真核翻譯起始因子1(eukaryotic translation initiation factor 1，Eif1)在真核細胞蛋白質翻譯起始過程中發(fā)揮重要作用。表達明顯下調的蛋白有5個：微管蛋白酪氨酸連接酶類似物12(tubulin-tyrosine ligase-like protein 12，Ttll12)可以在微管蛋白的羧基末端翻譯后修飾；細胞角蛋白19(keratin、type I cytoskeletal 19，Krt19)對維持細胞結構的完整性起重要作用；細胞角蛋白14(keratin、type I cytoskeletal 14，Krt14)參與形成上皮細胞的細胞骨架；真核翻譯起始因子3亞基K(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit K，Eif3k)是真核翻譯起始因子3復合物的組分；真核延伸因子1 A 2(elongation factor 1-alpha2，Eef1a2)在蛋白質合成過程中促進氨酰tRNA與核糖體A位點的GTP依賴性結合。

參與轉錄調節(jié)的蛋白有5個，表達明顯上調的蛋白為PDZ和LIM域蛋白1(PDZ and LIM domain protein 1,Pdlim1)，參與成纖維細胞中應力纖維的組裝、拆卸和定向。表達明顯下調的蛋白有4個：絲氨酸/精氨酸重復性基質蛋白1(serine/arginine repetitive matrix protein 1，Srrm1)是參與眾多前mRNA加工過程；Ras相關蛋白Rap-1b(Ras-related protein Rap-1b，Rap1b)在內皮屏障功能的建立中起作用；叉頭盒蛋白M1(forkhead box M1，F(xiàn)oxm1)在控制細胞增殖中起重要作用；Ras GTP酶活化蛋白結合蛋白2(Ras GTPase-activating protein-binding protein 2，G3bp2)是參與mRNA轉運的支架蛋白。

以上表達差異有顯著性的蛋白在多種生物過程中發(fā)揮功能，但與脂質代謝相關性較少。為尋找LRTPG調脂作用的靶點，我們篩選出參與脂質代謝過程的8個差異蛋白進行深入分析，見Tab 2。

2.4.1脂質代謝相關的上調蛋白 脂肪酸轉移酶(fatty acid translocase，F(xiàn)AT/CD36)對脂質的轉運內吞和信號傳導非常重要，可與游離脂肪酸結合，促進對游離脂肪酸的攝取[5]。本實驗中，LRTPG(1.2 g·kg-1)給藥組地鼠肝臟的CD36表達較模型組增高，由此推測，LRTPG可以通過上調肝臟CD36的表達，增加對游離脂肪酸的攝取，從而降低血中游離脂肪酸含量。

Tab 1 Differential protein of FC> 3 or FC<0.4

Tab 2 Lipid metabolism-related differential protein

肝刺激因子(hepatic stimulator substance，HSS)存在于哺乳動物的胚肝，以及部分切除后的殘余肝臟中。研究表明，加入外源性HSS蛋白可以促進肝細胞增殖，減少肝細胞內脂質的蓄積，使細胞免受脂質損傷[6]。本實驗中，LRTPG給藥組地鼠肝臟的HSS表達較模型組明顯增高，表明LRTPG可以通過促進肝臟中HSS的表達，降低肝臟中脂質的堆積，減輕肝損傷。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，LRTPG對高脂血癥金黃地鼠肝細胞病變具有明顯的減輕效果[2]。

丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)將磷酸烯醇式丙酮酸轉變成丙酮酸，是調節(jié)糖酵解的關鍵酶之一。PK被激活，葡萄糖分解加快。本實驗中，LRTPG給藥組地鼠肝臟的PK表達較模型組明顯增高，表明LRTPG可以通過激活PK，提高葡萄糖的分解代謝速度，從而減少葡萄糖轉化為脂質。

葡萄糖激酶(gluockinase，GCK)催化葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸。GCK活性微小的改變就會導致糖代謝很大的變化，被認為是具有前景的糖尿病治療藥物新靶點[7]。本實驗中，LRTPG給藥組地鼠肝臟的GCK表達較模型組明顯增高，表明LRTPG可促進高脂飲食金黃地鼠體內的葡萄糖合成肝糖原，進而避免肝臟將多余的能量轉變成脂肪儲存，減少肝臟脂質堆積。

載脂蛋白A I(apolipoprotein A I，ApoA I)是高密度脂蛋白的主要載脂蛋白，在外周組織中，ApoA I為游離膽固醇和磷脂的受體，能促進膽固醇的攝取，并且能夠將高密度脂蛋白中的膽固醇酯轉移到肝臟中進行代謝，阻止膽固醇在外周組織中的聚積[8]。LRTPG給藥組肝臟中ApoA I表達明顯升高，提示LRTPG可能通過上調ApoA I來促進膽固醇逆向轉運。

2.4.2脂質代謝相關的下調蛋白 ATP檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase，ACLY)是連接著葡萄糖降解與脂肪酸、膽固醇合成的關鍵代謝酶。ACLY通過影響乙酰輔酶A，控制脂肪酸從頭合成[9]。本實驗中，LRTPG給藥組地鼠肝臟的ACLY表達較模型組降低，表明LRTPG可通過抑制ACLY的表達來抑制脂肪酸的合成，進而減少肝臟中脂肪的堆積。

脂肪酸結合蛋白5(fatty acid binding protein 5，F(xiàn)ABP5)對硬脂酸和亞油酸具有高度親和力，并能特異性結合脂肪酸，通過調節(jié)細胞內脂肪酸轉運調控脂質代謝[10]。本實驗中，LRTPG給藥組地鼠肝臟的FABP5表達較模型組降低，表明LRTPG可通過減少FABP5的表達來抑制脂肪酸的轉運。

自水解酶域蛋白5(abhydrolase domain containing 5，ABHD5)可通過激活甘油三酯脂肪酶，調控脂肪分解代謝過程[11]。LRTPG給藥組相比模型組地鼠肝臟的ABHD5表達下調，表明LRTPG并未通過ABHD5來促進脂肪的分解代謝。

3 討論

中藥是中華民族的瑰寶，但是中藥成分復雜多樣，且無法很好地解釋中藥的作用靶點和機制，阻礙了中藥現(xiàn)代化的發(fā)展。將蛋白質組學技術應用于中醫(yī)藥相關研究中，比較細胞或動物模型給藥前后，相應靶器官或組織中蛋白質的變化，對中藥有效部位或有效成分作用靶點進行識別，有助于科學解釋中藥的作用機制。差異蛋白質定量分析是最為常見的定量蛋白質組學，包括同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)和非標記定量(label-free)。近年來，蛋白質組學技術廣泛的應用于中藥作用機制的研究中。Zhang等[12]利用iTRAQ技術，分析研究了茵陳五苓散對高脂血癥大鼠血漿和血管組織差異表達的蛋白，表明該藥的作用機制涉及脂質代謝、凝血、炎癥等通路。Zhou等[13]將一種由10種中藥組成的清肺口服液給予呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)感染的肺炎小鼠，利用label-free技術分析和比較小鼠血清蛋白質組的變化，揭示纖維蛋白肽B和肝素輔因子II是清肺口服液治療RSV肺炎的靶點，并且提示清肺口服液的作用與其改善RSV引起的機體免疫、炎癥、凝血反應的紊亂狀態(tài)密切相關。

我們前期的一系列藥效學研究已經(jīng)明確了LRTPG的調脂減肥功效，并闡明了LRTPG的部分調脂機制。肝臟作為脂質代謝的中心和最直接的臟器，它對機體脂質代謝的調節(jié)起到?jīng)Q定性作用。本研究選用高脂飼料誘導的高脂血癥模型組和LRTPG給藥組金黃地鼠的肝臟，應用label-free蛋白質組學技術比較和篩選了兩組金黃地鼠肝臟的差異表達蛋白，并進行生物信息學分析。KEGG通路分析表明，篩選出的差異蛋白參與到多種代謝途徑中，與脂質代謝相關的主要包括氧化磷酸化、非酒精性脂肪肝、PI3K-Akt等信號通路。進一步對差異蛋白進行篩選分析發(fā)現(xiàn)：(1)LRTPG通過上調CD36，增加對游離脂肪酸的攝取，并且下調FABP5、ACLY，抑制游離脂肪酸的轉運和合成，降低血清中游離脂肪酸的含量，減少肝臟的脂質堆積。秦佑等[14]發(fā)現(xiàn)，樹豆酮酸A可以通過減少游離脂肪酸的釋放來降低小鼠3T3-L1脂肪細胞總脂肪的含量；Furuhashi等[15]研究顯示，給予小鼠FABP抑制劑，可預防和治療動脈粥樣硬化和2型糖尿病；Pinkosky等[16]發(fā)現(xiàn)，ETC-1002可以通過激活AMPK和抑制ACLY的活性，減少高脂血癥金黃地鼠肝臟中TC、TG的含量，并且降低循環(huán)中致動脈粥樣硬化脂蛋白的含量。(2)LRTPG增加HSS的表達量，從而保護肝臟，降低肝損傷。Jiang等[17]發(fā)現(xiàn)，HSS基因轉移可抑制缺氧/復氧誘導的細胞死亡，以及缺血/再灌注造成的小鼠肝臟損傷。(3)LRTPG提高PK和GCK的活性，調節(jié)糖代謝來加快葡萄糖的分解，同時促進葡萄糖合成糖原，減少肝臟中脂肪的堆積，達到降低肝脂的效果。(4)LRTPG還可能通過上調ApoA I來促進膽固醇逆向轉運。Gordts等[18]發(fā)現(xiàn)，將人類ApoA I基因通過腺病毒注入小鼠體內，小鼠血漿中HDL-C水平升高，并且心肌梗死模型小鼠的死亡率降低。綜上所述，label-free蛋白質組學研究篩選出的與脂代謝相關差異表達的蛋白，很可能是LRTPG發(fā)揮調脂作用的潛在靶標蛋白，涉及不同生物學功能和信號通路。為證實LRTPG的調脂新靶點，我們擬采用Western blot、免疫組化等技術，進一步驗證蛋白質組學研究結果。

[致謝：本研究在中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室和中藥(天然藥物)創(chuàng)新藥物研發(fā)北京市重點實驗室完成，感謝實驗室老師和同學們給予的幫助和指導！]