經典Wnt/β-catenin/TCF7L2信號通路在1型糖尿病心肌病中的作用

邱曉霞，李逸朗，梁關鳳，張貴平，羅健東，袁文常，侯 寧

(1. 廣州醫科大學藥學院藥理學教研室，廣東 廣州 511436；2. 廣州醫科大學附屬第五醫院檢驗科，廣東 廣州 510000)

隨著人民生活水平的不斷提高，我國糖尿病患者迅速增多，至2016年，糖尿病的全年患病率從3.7%上升到6.6%，并且所有年齡段的糖尿病和糖尿病相關的死亡率分別增加了63.5%和33.3%，糖尿病對于我國人民的威脅已到了不可忽視的地步[1]。糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病性心臟病的特異性病變，是獨立于高血壓、冠狀動脈疾病的常見糖尿病并發癥，其發病機制非常復雜，迄今為止的研究和報道仍未完全闡明。因此，闡明DCM的發病機制，建立有效的治療方法和手段具有十分重要的意義。

經典的Wnt/β-catenin信號通路作為一條保守的信號傳導通路，廣泛存在于各生物體中，參與調控細胞增殖、遷移、分化等細胞發育過程[2]。該信號通路的異常調節與各種心臟疾病狀況有關，在心臟發育、心肌肥厚、心力衰竭等生理和病理生理進程中起重要作用[3]。TCF7L2作為T細胞因子/淋巴細胞增強子結合因子(T cell factor/lymphocyte enhancer factor，TCF/LEF)家族成員，是經典Wnt/β-catenin信號通路的下游核轉錄因子之一，參與細胞增殖、分化的調節[4-5]。近來研究發現，TCF7L2基因多態性與糖尿病存在明顯關聯。TCF7L2參與調節胰島β細胞分泌功能、細胞增殖與凋亡[6-7]；并能調控肝臟糖、脂代謝基因的表達，參與能量代謝穩態調節；特異性敲除肝臟TCF7L2能提高胰島素敏感性，改善糖耐量，降低肝糖合成[8]。此外，在β-catenin的作用下，TCF7L2與LEF共同調節胰高血糖素原基因的表達，以及胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptid-1，GLP-1)的分泌，從而調節機體血糖穩態。但是在糖尿病心臟中，β-catenin/TCF7L2通路的具體作用，目前尚不完全清楚。因此，本研究以C57BL/6小鼠為主要對象，通過腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)建立1型糖尿病(diabetic mellitus，DM)模型, 明確β-catenin/TCF7L2通路對心肌肥大標志基因心房鈉尿肽前體A基因(natriuretic peptide precursor A，Nppa)以及DCM發生、發展中的作用及機制。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6 ♂小鼠，7～8周齡，體質量(20±4) g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證：SCXK(粵)2013-0034。飼養環境模擬自然晝夜條件，溫度(22±3)℃，濕度40%～45%，自由飲水。

1.2 藥物與試劑β-catenin轉錄抑制劑14(inhibitors of β-catenin responsive transcription 14，iCRT14)(MCE公司，批號677331-12-3)；STZ(Sigma公司)；RIPA裂解液(Cell Signaling Technology公司)；蛋白酶與磷酸酶抑制劑(Selleck公司)；TCF7L2、β-catenin、活化的β-catenin、GAPDH抗體(Cell Signaling Technology公司)；TRIzol(Ambion公司); BCA蛋白試劑盒(Thermo Fisher公司)。

1.3 儀器MDF-381AT型-70 ℃低溫冰箱(日本三洋)；電子血糖儀(美國SD BIOSENSOR);低溫高速離心機(德國Hettich)；StepOnePlus Real-Time PCR儀(Applied Biosystems公司)；凝膠電泳儀、電泳槽(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 動物造模與分組7～8周齡C57BL/6小鼠腹腔注射用檸檬酸緩沖液配好的STZ 45 mg·kg-1·d-1，連續注射6 d。正常組給予等量的檸檬酸緩沖液。注射結束3 d后，測量小鼠隨機血糖，血糖濃度高于1.67×10-2mol·L-1的小鼠視為造模成功。DM成模4周后，將血糖穩定的小鼠隨機分,4組：正常對照組(control，CON)、糖尿病模型組(DM)、iCRT14低、高濃度組(2.5、5.0 mg·kg-1)，每組8～10只小鼠。隔天腹腔注射藥物1次，連續給藥8周。給藥期間，正常飲食，自由飲水。

2.2 HE染色各組小鼠麻醉后，摘取心臟，并用PBS洗凈殘留血液，用4%多聚甲醛浸泡24 h后，脫水浸蠟，制作石蠟切片，切片用蘇木精和伊紅染色，光鏡顯微鏡下觀察分析心肌組織病理學變化。

2.3 免疫組化檢測TCF7L2和β-catenin蛋白在細胞中的分布將石蠟切片脫蠟至水后，用檸檬酸抗原修復緩沖液修復抗原。3% BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min，加入一抗4 ℃孵育過夜，同屬性二抗室溫孵育50 min，DAB顯色、蘇木精復染細胞核后，脫水封片。

2.4 Western blot檢測TCF7L2和β-catenin蛋白表達取各組小鼠左心組織，制備組織勻漿，每20 mg組織加入100～200 μL RIPA裂解液，冰上研磨棒研磨20 s，3次，渦旋勻漿30 s，冰上靜置5 min，重復3次，4 ℃、14 000×g離心30 min，取上清，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。20～50 μg總蛋白上樣量，以濃度為10%的凝膠電泳進行分離，濕法轉膜。5%的脫脂奶粉封閉1 h后，與相應一抗4 ℃孵育過夜，0.1% PBS-T溶液洗滌，同屬性二抗共孵育，增強型化學發光試劑進行顯色，利用灰度分析軟件定量分析。

2.5 qPCR檢測β-catenin、Tcf7l2、Nppa和c-Myc mRNA表達取各組左心室組織50 mg，均勻粉碎后，按TRIzol提取程序說明書提取組織RNA; 在260 nm吸光值下定量RNA，按TaKaRa逆轉錄試劑盒操作說明，分兩步在42 ℃ 2 min，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s進行逆轉錄為cDNA。使用TaKaRa SYBR試劑盒在qPCR儀器上以95 ℃ 1 s、60 ℃ 20 s進行擴增，讀取最后擴增數值。引物序列見Tab 1。

2.6 統計學處理采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

3 結果

3.1 心肌組織結構改變Fig 1的HE染色結果顯示，CON組心肌細胞排列整齊，形態清晰；DM組心肌細胞排列紊亂，細胞結構模糊、表面積增大；與DM組相比，iCRT14組隨藥物劑量增加，細胞排列較整齊，形態逐漸均勻，逐漸趨向于正常細胞。

Fig 1 Morphological characteristics of diabeticcardiomyopathy by HE staining(×400)

A:CON;B:DM;C:DM+iCRT14(2.5 mg·kg-1);D:DM+iCRT14(5 mg·kg-1)

3.2 TCF7L2和β-catenin蛋白在心肌中的分布如Fig 2所示，正常組中β-catenin主要分布在心肌細胞連接的閏盤處，TCF7L2則散落分布在少數的心肌細胞核內。DM組中，β-catenin在閏盤和心肌細胞核內均見明顯表達，且核內表達明顯增多，提示DM時β-catenin入核增多；DM組心肌細胞核中TCF7L2表達明顯增多，與β-catenin趨勢一致。與DM組對比，給予iCRT14后，心肌細胞核內β-cate-nin表達減少，主要分布在閏盤和細胞質內，細胞核內TCF7L2表達也隨之減少。提示1型DM時，TCF7L2和β-catenin在心肌細胞核內表達增多，給予iCRT14能明顯抑制兩者在細胞核內的表達和結合。

Fig 2 Expression and distribution of TCF7L2 and β-catenin in hearts by immunohistochemistry(×400)

3.3 TCF7L2和β-catenin蛋白表達情況如Fig 3所示，與CON組對比，DM組活化β-catenin、總β-catenin、TCF7L2蛋白表達均明顯增多；給予iCRT14能抑制β-catenin、TCF7L2蛋白的表達。該結果與免疫組化結果一致，提示1型DM心臟中β-catenin/TCF7L2信號通路活化，iCRT14能抑制β-catenin入核與TCF7L2結合，同時可抑制TCF7L2蛋白表達。

3.4 Tcf7l2、β-catenin、c-Myc、Nppa mRNA表達變化如Fig 4所示，與CON組相比，DM組Tcf7l2、c-Myc、Nppa mRNA表達上升，給予iCRT14后上述基因的mRNA水平下降，而β-catenin mRNA水平在DM組和iCRT14組有增加和減少的趨勢，但差異無統計學意義。

4 討論

DCM主要表現為心室舒張和收縮功能降低、心肌肥厚、心肌間質纖維化等[9]。深入研究并闡明DCM的分子機制并找出早期的干預靶點，對建立更有效的糖尿病心血管并發癥治療方法具有十分重要的意義。

β-catenin作為經典Wnt通路的核心調控因子，在Wnt信號通路未被激活時，β-catenin在胞質內與腺瘤性結腸息肉病基因蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、軸蛋白(Axin)、糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、酪蛋白激酶1(casein kinase 1，CK1)等，形成“β-catenin降解復合物”，促進β-catenin進入蛋白酶體降解途徑，使胞質內游離β-catenin維持在較低水平。Wnt通路激活后，促進β-catenin自降解復合物解離，減少蛋白酶體降解，使胞質內游離β-catenin穩定積累并進入細胞核內，由于β-catenin不含有DNA結合域，故當其進入細胞核后，需要與核內TCF7L2及其它TCF轉錄因子相互作用，形成轉錄激活復合物，激活下游靶基因轉錄。

Fig 3 Expression of β-catenin and TCF7L2 in

##P<0.01vsCON;**P<0.01vsDM

Fig 4 β-catenin, Tcf7l2, c-Myc and Nppa mRNAexpressions in myocardial tissue of

#P<0.05,##P<0.01vsCON;*P<0.05,**P<0.01vsDM

研究表明，β-catenin在維持血漿葡萄糖的穩態中起著重要的作用。β-catenin轉移至細胞核中，與LEF/TCF7L2結合形成異二聚體，激活胰高血糖素原基因等在內的大量基因發生轉錄，胰高血糖素原基因轉錄后，經不同的組織特異性加工，在胰島α細胞表達產生胰高血糖素，使小腸L細胞表達產生胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)和胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide 2，GLP-2)。其中，由小腸L細胞分泌的GLP-1不僅能刺激胰島素合成與分泌，抑制胰高血糖素釋放，增加外周胰島素敏感性，還能通過抑制胃排空、增加機體飽脹感來降低血糖[10]。以往的研究顯示，DM時高糖可通過激活β-catenin，加劇糖尿病視網膜病[11]。在腎臟中，高糖激活的β-catenin加速糖尿病腎病的病理生理進程[12]。國內也有研究發現，β-catenin的激活參與早期DM心肌損傷[13]。β-catenin/TCFL2信號通路在DCM中扮演何種角色，目前尚不清楚，亟待深入研究。因此，本課題通過建立1型DM小鼠模型，觀察持續高血糖狀態對心臟β-catenin/TCFL2信號通路的影響。結果發現，12周DM組心肌細胞排列紊亂，表面積增大，心肌肥大標志基因Nppa mRNA表達上調，呈現DCM的病理特征。免疫組化和Western blot結果顯示，12周DM組心肌中β-catenin表達明顯上調，且入核增多；TCF7L2蛋白表達也隨之升高。隨后，利用qPCR檢測β-catenin/TCFL2通路的經典下游靶基因c-Myc表達。c-Myc是一種常見的原癌基因，主要通過參與細胞周期的調控，促進細胞增殖。已有研究顯示，c-Myc過度表達能誘導心肌肥厚。課題組前期研究證實，c-Myc在心力衰竭的人類樣本和轉基因動物心臟中均表達增高，β-catenin/TCFL2信號通路通過上調c-Myc表達，參與心力衰竭的病程發展[14]。本研究qPCR結果顯示，c-Myc mRNA表達在DM組的心臟中也明顯增高。上述一系列結果提示，持續的高糖環境能激活心臟Wnt/β-catenin/TCFL2信號通路。

為進一步明確Wnt/β-catenin/TCFL2信號通路活化在DCM中的作用，我們選擇新型β-catenin通路抑制劑iCRT14(Thiazolidinedione)處理DM組。iCRT14是最近報道的一種抑制β-catenin/TCF7L2結合的小分子化合物，能抑制β-catenin和TCF7L2的結合，同時還可干擾TCF家族與DNA的結合，抑制下游基因轉錄[15]。有體內外研究顯示，iCRT14通過抑制Wnt/β-catenin信號轉導，抑制乳腺癌和前列腺癌細胞增殖。本研究連續給予DM組腹腔注射iCRT14 8周，HE染色結果顯示，iCRT14組心肌結構明顯改善，細胞排列逐漸整齊，形態均勻，細胞核大小一致。免疫組化和Western blot結果顯示，給予iCRT14后，β-catenin核內表達減少，TCF7L2表達降低。qPCR結果顯示，c-Myc、Nppa mRNA表達均明顯下降，接近CON組。該研究結果表明，iCRT14能阻斷β-catenin/TCF7L2結合，抑制該信號通路的活性；同時提示，抑制Wnt/β-catenin/TCF7L2通路能明顯改善DCM的病理表征。

綜上所述，本課題研究發現，持續的血糖升高能激活心臟Wnt/β-catenin/TCF7L2信號通路，該通路的活化參與DCM的病理生理進程。在后續研究中我們將進一步在細胞水平，探索Wnt/β-catenin/TCF7L2信號通路在DM心肌重構中的具體作用和分子機制，為探索DCM治療的新靶點提供實驗依據。