沒藥甾酮下調PI3K/Akt通路增強替莫唑胺抗腦膠質瘤細胞增殖作用

湯兆奇，王克生，徐宏彬, 3, 4

(1. 南京醫科大學上海十院臨床醫學院，江蘇 南京 211166; 2. 上海市第十人民醫院中心實驗室，上海 200072;3. 上海市第十人民醫院藥學部，上海 200072; 4. 上海市第十人民醫院崇明分院藥劑科，上海 202157)

膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是最具侵襲性的惡性原發性腦腫瘤，占原發性腦腫瘤的16%[1]。目前，GBM的標準治療是手術配合放化療，由于腫瘤所在位置及高侵襲性，手術難以完全切除[2]。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是GBM化療的一線藥物，主要通過使DNA甲基化而導致DNA錯配修復系統失效，并最終導致腫瘤細胞死亡[3]。目前，GBM的治療方法預后并不好，患者中位生存期只有15個月，僅有少部分存活達2.5年，5年生存率不到5%[1]。因此，GBM的治療需要更加有效的方案。近來研究表明，膠質瘤細胞中多伴有磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt通路過度活化，該通路的激活促進了膠質瘤細胞的侵襲、轉移及耐藥的產生[4]。PI3K抑制劑BKM120可通過下調PI3K/Akt通路表達，恢復GBM細胞對TMZ的敏感性，增強其療效[5]，提示該通路可作為GBM治療的手段。

沒藥為橄欖科植物沒藥樹的油膠樹脂，沒藥甾酮(guggulsterone，GS)是沒藥中的主要活性成分，包含Z和E兩種同分異構體[6]。目前研究表明，GS可通過抑制PI3K p85及Akt(Ser473)和(Thr308)位點磷酸化，抑制頭頸癌細胞SCC4增殖，并誘導其凋亡[7]。但是GS對膠質瘤PI3K/Akt通路的調控作用，至今未有報道。我們前期研究發現，GS能增強化療藥物阿霉素對白血病細胞K562和乳腺癌細胞MCF-7的增殖抑制和凋亡誘導作用[8]。本文擬探討Z-沒藥甾酮(Z-GS, 化學結構見Fig 1)能否通過下調PI3K/Akt通路，增強TMZ對人腦膠質瘤細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用，為尋找新的GBM化療方案提供理論依據。

Fig 1 Chemical structure of Z-guggulsterone

1 材料

1.1 藥物與試劑Z-沒藥甾酮(Z-GS), 購自美國Sigma公司，溶于DMSO，配成母液16 003 μmol·L-1；TMZ購自美國Sigma公司，溶于DMSO，配成母液51 506 μmol·L-1；CCK-8，購自日本同仁化學研究所；Hoechst 33342染料，購自上海碧云天生物技術公司；凋亡試劑盒，購自美國Invitrogen公司；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、Bcl-2、Bax、β-actin抗體，購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 儀器Synergy2多功能酶標儀(美國BioTek公司)；DMI 6000B倒置顯微鏡(德國Leica公司)；FACSCanto Ⅱ流式細胞儀(美國BD公司)；Odyssey雙色紅外激光成像系統(美國LI-COR公司)。

2 方法

2.1 細胞培養與藥物處理人膠質瘤細胞U251，購自中國科學院上海細胞庫。用含有10%胎牛血清、100 μmol·L-1青霉素和鏈霉素的DMEM培養液(美國Gibco公司)，在5% CO2、37 ℃條件下培養。當細胞長至培養皿底部80%時，用胰酶消化并接種至孔板中，待細胞長至孔板底部80%時，棄去舊培養液，分組加入含不同濃度藥物的完全培養液。

2.2 CCK-8法檢測細胞增殖取對數生長期細胞接種于96孔板中，每孔細胞量為1×104，每孔液體量為100 μL。Z-GS和TMZ單藥處理的藥物濃度梯度均為1、3、10、30、100、200、400 μmol·L-1；Z-GS與TMZ聯合使用中，TMZ(1、3、10、30、100、200、400 μmol·L-1)分別與30 μmol·L-1Z-GS聯合使用，每個濃度3個復孔。細胞經藥物處理12、24、48 h后，加入10% CCK-8試劑，于培養箱中反應2 h，用酶標儀測450 nm處OD值。每組實驗重復4次。

使用公式：存活率/%=OD實驗組平均值/OD對照組平均值×100%，計算細胞存活率。

2.3 合用指數(combination index, CI)計算使用Excel 2016軟件，得到GS和TMZ單藥的擬合量效曲線及函數方程。使用公式CI=DA,x/DB,x+ICx,A/ICx,B計算CI，其中DA,x和DB,x為兩藥聯用達到x效應時兩藥的濃度，ICx,A和ICx,B為兩藥單獨使用時達到x效應所需的濃度。CI<1表示兩藥協同，CI=1表示兩藥相加，CI> 1表示兩藥拮抗[9]。

2.4 Hoechst 33342染色取對數生長期細胞接種于6孔板中，每孔細胞量為3×105，每孔液體量為2 mL。用Z-GS(30 μmol·L-1)和TMZ(400 μmol·L-1)單藥及兩藥聯合處理細胞24 h。棄培養液，每孔加Hoechst 33342試劑1 mL，置于培養箱中30 min，棄染料，PBS洗3遍，使用倒置熒光相差顯微圖像系統觀察并采集圖像。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡取對數生長期細胞接種于6孔板中，每孔細胞量為3×105，每孔液體量為2 mL。用Z-GS(30 μmol·L-1)和TMZ(400 μmol·L-1)單藥及兩藥聯合處理細胞。藥物處理細胞24 h后分別收集細胞和上清液，PBS洗2次，胰酶消化，與之前收集的上清液混合，細胞懸液1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，PBS重懸，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入1×binding buffer 50 μL重懸，再加入Annexin V-FITC 5 μL，避光反應15 min，加入PI 5 μL，5 min后加入1×binding buffer 300 μL混勻，使用流式細胞儀檢測，使用FACSDIVA軟件分析。實驗重復3次。

2.6 Western blot檢測蛋白表達取對數生長期細胞接種于6孔板中，每孔細胞量為3×105，每孔液體量為3 mL。用Z-GS單藥(30 μmol·L-1)、TMZ單藥(400 μmol·L-1)及兩藥聯合處理細胞，24 h后提取蛋白。BCA法測定樣品蛋白濃度，上樣量為50 μg。樣品經SDS-PAGE電泳分離，之后轉移至NC膜上，用5% BSA室溫下在搖床上封閉1 h，用封閉液稀釋抗體(β-actin抗體按1 ∶5 000稀釋，其余一抗按1 ∶1 000稀釋)，一抗4 ℃過夜孵育，之后用PBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫下避光孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，用Odyssey紅外激光成像系統采集圖片，用Odyssey軟件分析圖像。實驗重復3次。

2.7 統計學分析使用SPSS 17.0軟件進行數據分析。組間均數比較采用兩獨立樣本t檢驗。

3 結果

3.1Z-GS、TMZ及兩藥聯合對U251細胞增殖的影響Fig 2、3結果顯示，Z-GS和TMZ對U251細胞的增殖抑制作用呈時間及濃度依賴性。與TMZ單藥組相比，GS聯合TMZ能明顯增強對U251細胞的增殖抑制作用。

Fig 2 Effects of Z-guggulsteroneon proliferation in U251

U251 cells were treated withZ-guggulsterone(1～400 μmol·L-1) for 12 h, 24 h or 48 h as determined by CCK-8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

3.2Z-GS、TMZ及兩藥聯合對U251細胞凋亡影響Fig 4結果顯示，與對照組相比，Z-GS單獨給藥組細胞凋亡率為(5.3±1.0)%，TMZ單獨給藥組細胞凋亡率為(12.7±1.7)%；與TMZ單獨給藥組相比，聯合給藥能明顯增強對U251細胞凋亡誘導作用，凋亡率上調至(29.5±4.3)%(P<0.01)。

3.3Z-GS、TMZ及兩藥聯合對U251細胞PI3K/Akt通路的影響Fig 5結果顯示，與對照組相比，Z-GS單獨給藥組明顯下調了PI3K、p-PI3K p110、Akt和p-Akt(Thr308)表達，TMZ單獨給藥組明顯下調了PI3K、p-PI3K p110、p-PI3K p85和p-Akt(Ser473)表達；與TMZ單獨給藥組相比，聯合給藥明顯下調了PI3K、p-PI3K p110和p-Akt(Ser473)表達。

3.4Z-GS、TMZ及兩藥聯合對U251細胞Bcl-2和Bax表達的影響Fig 6結果顯示，與對照組相比，兩藥單獨給藥對Bcl-2和Bax表達影響均無統計學差異(P>0.05)；與TMZ單獨給藥組相比，聯合用藥明顯下調了Bcl-2表達(P<0.01)。

4 討論

本實驗結果顯示，與TMZ單獨給藥相比，Z-GS能增強TMZ對U251細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用。進一步研究顯示，與TMZ單獨給藥相比，GS能明顯下調PI3K、p-PI3K p110、p-Akt(Ser473)和Bcl-2的表達。研究結果表明，沒藥甾酮可通過下調PI3K/Akt通路，增強替莫唑胺對人腦膠質瘤細胞U251的增殖抑制作用。

Fig 3 Effects of temozolomideor temozolomide combined with Z-guggulsteroneon proliferation of U251

U251 cells were treated with temozolomide(1～400 μmol·L-1) alone or in combination withZ-guggulsterone(30 μmol·L-1) for 12 h(A), 24 h(B) or 48 h(C) as determined by CCK-8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsTMZ alone at the same concentration.

U251 cells were treated withZ-guggulsterone(30 μmol·L-1) and temozolomide(400 μmol·L-1) alone or in combination for 24 h. A:Nuclear morphology of U251 cells stained with Hoechst 33342; B: Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC/PI double staining; C: Apoptosis rate from flow cytometer analysis.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTMZ.

PI3K由催化亞基p110和調節亞基p85組成，p85與效應物結合后釋放出p110，p110將磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidy-linositol-3, 4-bisphosphate，PIP2)磷酸化為磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidy-linositol-3, 4, 5-bisphosphate，PIP3)，PIP3招募Akt，并使其Thr308和Ser473位點磷酸化[10]。其中，Thr308殘基位于Akt的核心，其磷酸化為Akt活化所必需，Ser473殘基的磷酸化能穩定Thr308磷酸化和Akt活化狀態，使Akt活性最大化[11]。Akt可以激活下游的目的蛋白，如核轉錄因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、mTOR等，從而促進細胞增殖[12]。Chen等[13]研究發現，PI3K抑制劑LY294002能抑制腦膠質瘤U87細胞中PI3K和p-Akt水平，與TMZ聯用，增強其對U87細胞的增殖抑制作用。Mao等[5]研究發現，PI3K抑制劑BKM120也能通過下調PI3K、p-Akt，恢復膠質瘤細胞C6對TMZ的敏感性。還有研究表明，通過抑制Akt下游的NF-κB，也可促進膠質瘤細胞凋亡[14]。本研究發現，Z-GS通過下調PI3K、p-PI3K p110和p-Akt(Ser473)表達，增強TMZ對U251細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用。

磷酸化的Akt可通過磷酸化BAD，釋放出Bcl-2，抑制細胞凋亡[15]。Chen等[13]研究發現，與單獨使用TMZ相比，PI3K抑制劑LY294002聯合TMZ可明顯下調腦膠質瘤U87細胞中Bcl-2的表達，同時上調Bax表達。Mao等[5]研究發現，與單獨使用TMZ相比，PI3K抑制劑BKM120聯合TMZ可明顯上調腦膠質瘤C6細胞中Bax表達。本研究發現，與單獨使用TMZ相比，Z-GS聯合TMZ可明顯下調腦膠質瘤U251細胞中Bcl-2的表達。

Fig 5 Effects of Z-GS and TMZ on expression of PI3K, p-PI3K p110, p-PI3K p85(A) and Akt, p-Akt(Ser473), p-Akt(Thr308)(B) in U251

U251 cells were treated withZ-GS(30 μmol·L-1) and TMZ(400 μmol·L-1) alone or in combination for 24 h.*P<0.05,**P<0.01vscontrol,#P<0.05,##P<0.01vsTMZ.

Fig 6 Effects of Z-GS and TMZ on expressionsof Bcl-2 and Bax in U251

U251 cells were treated withZ-GS(30 μmol·L-1) and TMZ(400 μmol·L-1) alone or in combination for 24 h.**P<0.01vscontrol,##P<0.01vsTMZ.

TMZ作為GBM的一線化療藥物，其單獨使用的療效并不令人滿意，本實驗結果表明，Z-GS有望改善TMZ的療效，具有與TMZ聯合用于GBM治療的應用前景。但Z-GS對膠質瘤PI3K/Akt通路影響及聯合作用機制，仍需要進一步的研究，今后還將開展體內實驗，為Z-GS用于GBM治療提供依據。

(致謝:本實驗在上海市第十人民醫院中心實驗室完成，感謝各位老師的幫助。)