注射用核糖核酸Ⅱ通過活性氧介導(dǎo)的PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)人白血病細胞KG1a凋亡

郭 珮，李 靜，冉建華，陳地龍,4，何 菲，呂曉婷，石雪萍，李海星

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織細胞工程與干細胞研究室，重慶 400016；2. 重慶市第六人民醫(yī)院/重慶市職業(yè)病防治院藥學(xué)部，重慶 400060；3. 重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，重慶 400016；4. 重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 404120)

注射用核糖核酸Ⅱ(商品名BP素)具有抗腫瘤和提高免疫功能的作用，是從牛胰腺提取的高純度、具有生物活性的核糖核酸[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，注射用核糖核酸Ⅱ可通過上調(diào)p53、調(diào)控Bcl-2/Bax的表達、激活caspase-3來誘導(dǎo)人急性骨髓白血病細胞株KG1a細胞凋亡，但未深入探討p53上、下游的凋亡信號分子在其中的作用[2]。目前，臨床上已有采用注射用核糖核酸Ⅱ治療肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤的報道，但對白血病的治療和機制研究甚少[3]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)作為細胞內(nèi)關(guān)鍵的信號分子，參與了細胞凋亡的啟動和執(zhí)行[4]。在調(diào)控細胞凋亡增殖的信號通路中，PI3K/Akt信號通路發(fā)揮重要作用，通過激活A(yù)kt及其下游靶點p53等，對促進細胞周期進展、增殖、生存和抗凋亡有重要作用[5]。在許多腫瘤細胞的凋亡過程中，ROS與PI3K/Akt信號通路密切相關(guān)，且ROS水平與Akt的活化息息相關(guān)[6]。本研究旨在研究注射用核糖核酸Ⅱ是否通過ROS介導(dǎo)的PI3K/Akt信號通路，誘導(dǎo)KG1a細胞凋亡，為注射用核糖核酸Ⅱ治療白血病提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人急性骨髓白血病細胞株KG1a，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)。

1.1.2藥品與試劑 注射用核糖核酸Ⅱ(規(guī)格50 mg)，購自吉林敖東藥業(yè)集團延吉股份有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清，購自美國Gibco公司；N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、PMSF(100 nmol·L-1)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、RIPA裂解液(強)，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；ROS檢測試劑盒，以及β-actin、p-PI3K、p-Akt、p-MDM2、p21抗體，購自巴傲得生物科技有限公司；ECL顯色劑，購自Milliproe公司；cyclin D1、周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)抗體，購自沈陽萬類科技有限公司。

1.1.3儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific公司)；凝膠成像儀、電泳儀、ChemiDo-CTMTouch Image Syste 化學(xué)發(fā)光儀(美國Bio-Rad公司)；倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；FACS-can型流式細胞儀(Becton Dickinson公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人急性骨髓白血病KG1a細胞培養(yǎng)基體系是90% RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液混合而成。細胞置于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)，每隔24 h觀察細胞狀態(tài)，每隔2～3 d換液傳代。

1.2.2藥物的配制 注射用核糖核酸Ⅱ的配制：用500 μL高溫消毒后的DEPC水與50 mg注射用核糖核酸Ⅱ粉末充分溶解，將終濃度為100 g·L-1的儲存液放于-20 ℃儲存。實驗前用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。NAC的配制:稱取0.163 19 g NAC，用1 mL PBS充分混勻，配制成1 mol·L-1NAC溶液，-20 ℃儲存,實驗前再用細胞培養(yǎng)液稀釋至10 mmol·L-1備用。

1.2.3流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測細胞周期 取培養(yǎng)的對數(shù)生長期KG1a細胞，細胞濃度調(diào)整為1×109·L-1，接種于6孔板。第一組實驗分組：Control組常規(guī)培養(yǎng)；實驗組在培養(yǎng)液中加入終濃度為100、150、200 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ。第二組實驗分組：Control組：為常規(guī)培養(yǎng)；藥物組：注射用核糖核酸Ⅱ濃度為150 mg·L-1；NAC對照組：用濃度為10 mmol的NAC溶液預(yù)處理細胞30 min，再給予濃度為150 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ。在37 ℃、5% CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細胞，用預(yù)冷pH 7.2的PBS液漂洗細胞2次，4 ℃、1 000×g離心5 min。棄上清，加70%乙醇固定過夜，送檢。每組樣本測定3×104個細胞，上流式細胞儀檢測，然后采用CellQuest軟件分析得出細胞凋亡周期，實驗重復(fù)3次。

1.2.4FCM檢測細胞內(nèi)ROS 取10 μL DCFH-DA用PBS液稀釋至10 mL，充分混勻避光備用。實驗分組培養(yǎng)后，收集各組細胞，用預(yù)冷的PBS液漂洗2次，4 ℃、1 000×g離心5 min。陰性對照組不加稀釋液；Control組和加藥組培養(yǎng)均加入1 mL稀釋液，孵育箱避光反應(yīng)30 min，每5 min混勻1次至反應(yīng)完全。最后用PBS洗滌4次，以除去細胞外熒光劑。用200 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀分析熒光強度，收集數(shù)據(jù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.5Western blot檢測 實驗分組同“1.2.3”，加藥分組培養(yǎng)后，收集各組細胞，用預(yù)冷的PBS漂洗細胞2次，4 ℃、1 000×g離心5 min。將細胞裂解液、1% PMSF冰上混勻，加100 μL至細胞中，置于冰上10 min，然后渦旋混勻，重復(fù)3次，4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液即為所提細胞總蛋白，BCA法檢測各組蛋白濃度。按每孔50 μg上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5% BSA溶液37 ℃封閉2 h，一抗孵育過夜(p-PI3K、p-Akt、p-MDM2、p21、cyclin D1、CDK4、p53均為1 ∶1 000稀釋, β-actin為1 ∶10 000稀釋)，TBST洗膜3次，每次15 min，二抗(1 ∶10 000)37 ℃孵育30 min，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL發(fā)光液孵育，曝光，使用配套軟件檢測各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 注射用核糖核酸Ⅱ阻滯KG1a細胞在G0/G1期Fig 1的FCM結(jié)果顯示，注射用核糖核酸Ⅱ(100、150、200 mg·L-1)作用KG1a細胞后，隨藥物濃度的增高，G0/G1期細胞比例增加，而G2/M期、S期比例則逐漸減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示注射用核糖核酸Ⅱ抑制急性骨髓白血病KG1a細胞的增殖活性與其阻滯細胞周期有關(guān)。

2.2 注射用核糖核酸Ⅱ?qū)G1a胞內(nèi)ROS的影響如Fig 2所示，注射用核糖核酸Ⅱ(100、150、200 mg·L-1)作用KG1a細胞后，KG1a細胞的熒光強度與對照組相比明顯升高(P<0.05)。提示注射用核糖核酸Ⅱ作用KG1a細胞24 h后，以濃度依賴方式增加KG1a細胞內(nèi)ROS含量。

2.3 注射用核糖核酸Ⅱ?qū)I3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的影響KG1a細胞經(jīng)注射用核糖核酸Ⅱ(100、150、200 mg·L-1)誘導(dǎo)24 h后，提取細胞總蛋白進行電泳分析。Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，p-PI3K、p-Akt、p-MDM2、cyclin D1和CDK4蛋白表達水平隨注射用核糖核酸Ⅱ濃度的增高而下調(diào)，而p21蛋白表達水平逐漸增高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示注射用核糖核酸Ⅱ可能通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路，阻滯KG1a細胞在G0/G1期，誘導(dǎo)KG1a細胞凋亡。

2.4 NAC和注射用核糖核酸Ⅱ?qū)G1a細胞周期的影響為進一步研究ROS是否介導(dǎo)注射用核糖核酸Ⅱ?qū)G1a細胞周期的阻滯作用，用NAC和注射用核糖核酸Ⅱ作用之后，檢測KG1a細胞周期的改變。如Fig 4所示，與單獨使用注射用核糖核酸Ⅱ組相比，NAC組G0/G1期細胞比例減少，而G2/M期、S期比例則增加。NAC組和單獨藥物組G0/G1期比例分別為37.69%和46.11%，與對照組28.98%相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示ROS介導(dǎo)了注射用核糖核酸Ⅱ阻滯KG1a細胞周期。

Fig 1 Effect of ribonucleic acid Ⅱ on cell cycle of KG1a

*P<0.05vscontrol

Fig 2 Inhibitory effect of ribonucleic acid Ⅱ on intracellular ROS in KG1a

*P<0.05vscontrol

Fig 3 Effect of ribonucleic acid Ⅱ on PI3K/Akt signaling pathway in KG1a *P<0.05 vs control

Fig 4 Effect of ribonucleic acid Ⅱ and NAC on cell cycle of KG1a

1：Control;2:Ribonucleic acid Ⅱ+NAC;3:Ribonucleic acid Ⅱ.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsribonucleic acid Ⅱ+NAC

Fig 5 Effect of ribonucleic acid Ⅱ and NAC on protein expressions in KG1a

1:Control; 2:Ribonucleic acid Ⅱ+NAC; 3:Ribonucleic acid Ⅱ.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsribonucleic acid Ⅱ+NAC

2.5 NAC和注射用核糖核酸Ⅱ?qū)G1a細胞p-PI3K/p-Akt、p53表達的影響進一步研究PI3K/Akt信號通路與ROS的關(guān)系，首先用抗氧化劑NAC預(yù)處理細胞30 min，再用150 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ作用后，檢測p-PI3K/p-Akt與p53蛋白表達的變化。Fig 5的Western blot結(jié)果顯示，藥物組磷酸化PI3K/Akt蛋白明顯減少，而與藥物組相比，NAC組磷酸化PI3K/Akt蛋白水平上升；p53蛋白表達水平在藥物組明顯上調(diào)，而在NAC組p53蛋白水平的上調(diào)不如藥物組明顯；但兩組與對照組相比，磷酸化PI3K/Akt及p53表達水平變化差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。藥物組與NAC組蛋白表達差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)KG1a細胞凋亡過程中PI3K/Akt的活化、p53與ROS密切相關(guān)。

3 討論

白血病是惡性克隆性白細胞增殖異常、分化障礙、凋亡受阻和正常造血受抑制為特性的惡性造血系統(tǒng)疾病[7]。大量研究表明，白血病發(fā)病機制非常復(fù)雜，與抑癌基因失活、易位所引起的癌基因激活、染色體斷裂等多種因素相關(guān)[8]。眾多研究表明，刺激和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡已成為治療腫瘤的新方向，前期研究也證實，注射用核糖核酸Ⅱ通過誘導(dǎo)人急慢性白血病細胞凋亡，來達到抑制其增殖的作用。

注射用核糖核酸Ⅱ是免疫核糖核酸的成員之一，具有提高細胞免疫功能和抗腫瘤的作用。研究證明，注射用核糖核酸Ⅱ通過抑制腫瘤細胞DNA復(fù)制，特異性地抑制和殺傷腫瘤細胞，保護正常細胞的功能，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡[9]。前期工作證實，注射用核糖核酸Ⅱ能夠通過上調(diào)p53，誘導(dǎo)人急慢性白血病細胞凋亡[2]，為探究其具體機制指引了新的方向。

注射用核糖核酸Ⅱ通過調(diào)控p53基因，影響B(tài)cl-2/Bax，促進人白血病細胞的凋亡。細胞的惡性增殖很可能由周期調(diào)控異常引起，p53在細胞周期中調(diào)節(jié)G1和G2/M期校正點的檢測，與轉(zhuǎn)錄激活息息相關(guān)；其下游基因p21可與cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，引起G1期的阻滯，從而導(dǎo)致細胞增殖障礙。cyclin D1是細胞周期G1期向S期過渡的重要調(diào)控點，cyclin D1可通過結(jié)合并激活G1期特有的周期蛋白性激酶CDK4，促進細胞增殖。同時p21作為周期蛋白依賴性激酶抑制子，抑制CDK的活性，過表達p21引起細胞周期阻滯在G1期[10]。FCM結(jié)果顯示，注射用核糖核酸Ⅱ阻滯KG1a細胞周期在G0/G1期，并與ROS密切相關(guān)；Western blot結(jié)果顯示，注射用核糖核酸Ⅱ作用后，cylin D1、CDK4的表達明顯下調(diào)，同時p21表達升高，與細胞周期阻滯于G0/G1期一致。表明注射用核糖核酸Ⅱ通過下調(diào)cylin D1、CDK4及上調(diào)p21來調(diào)節(jié)細胞周期，從而抑制KG1a細胞增殖。注射用核糖核酸Ⅱ通過p53調(diào)控p21，引起G1期的阻滯，導(dǎo)致KG1a細胞凋亡，誘導(dǎo)G1周期阻滯，與其他類型腫瘤被誘導(dǎo)凋亡機制相一致[11]。

前期研究證實了注射用核糖核酸Ⅱ?qū)θ思甭园籽〖毎哂性鲋骋种坪驼T導(dǎo)凋亡作用，與p53所在的凋亡信號通路存在密切聯(lián)系[2]。p53可在DNA受損后，以維持基因組穩(wěn)定來參與DNA的修復(fù)過程。較小的DNA損傷可導(dǎo)致細胞周期的阻滯，較嚴重的DNA損傷可導(dǎo)致細胞凋亡[12]。眾多關(guān)鍵的周期調(diào)控蛋白參與細胞凋亡的機制，p53調(diào)控p21引起周期阻滯，從而參與細胞凋亡的過程，提示p53協(xié)調(diào)的機制存在細胞周期和細胞凋亡。前期研究與本研究的FCM、Western blot結(jié)果均顯示，p53調(diào)控周期與凋亡的協(xié)調(diào)機制在注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)KG1a凋亡中占重要角色。PI3K是一個非常復(fù)雜的原癌基因家族，而PI3K本身就含有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶和磷脂酰肌醇激酶的活性。PI3K介導(dǎo)的信號通路在眾多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中具有重要作用，而p53基因在其中極為重要[13]。Akt是通過磷酸肌醇被募集到質(zhì)膜而被激活的一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞存活和凋亡中起重要作用，它能直接磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，抑制抑凋亡基因(如Bcl-2家族)的表達和增強抗凋亡基因(如p53等)的表達。PI3K/Akt信號通路下游的MDM2泛素連接酶能抑制p53，進而促進p53的降解或失活[14]。Western blot結(jié)果顯示，注射用核糖核酸Ⅱ作用后，p-PI3K、p-Akt和p-MDM2的表達明顯下調(diào)，同時p21表達升高。表明注射用核糖核酸Ⅱ通過下調(diào)磷酸化的PI3K/Akt，調(diào)控p53及其下游凋亡和周期相關(guān)蛋白的表達，從而誘導(dǎo)KG1a細胞的凋亡。

大量研究表明，紫外線、離子輻射、抗腫瘤藥物等，都能刺激形成內(nèi)源性ROS，在細胞凋亡過程中起重要作用。有研究報道，ROS可通過氧化還原修飾來影響細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，并可影響B(tài)ax、Bcl-2、p53等基因的表達[6]。許多抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞DNA片段化來誘導(dǎo)凋亡，均與引發(fā)胞內(nèi)ROS改變相關(guān)。例如ROS輕度升高可促進細胞增殖，中度ROS水平升高反而誘導(dǎo)細胞凋亡，更高ROS則直接導(dǎo)致細胞壞死[15]。本研究用注射用核糖核酸Ⅱ處理KG1a細胞，細胞內(nèi)ROS明顯上升，且呈濃度依賴性。研究發(fā)現(xiàn)，ROS的釋放可使Akt去磷酸化，從而使Akt及下游靶標失活，通過內(nèi)源性途徑引發(fā)細胞的凋亡[7]。注射用核糖核酸Ⅱ的抗腫瘤作用與DNA損傷有關(guān)，而DNA損傷與細胞凋亡中p53和cyclin-D1都緊密相關(guān)。因此，PI3K/Akt信號通路和ROS的關(guān)系是否與注射用核糖核酸Ⅱ?qū)Π籽〖毎脑鲋骋种谱饔孟嚓P(guān)，值得深入研究。在加抗氧化劑NAC后，注射用核糖核酸Ⅱ?qū)0/G1期的阻滯作用明顯低于注射用核糖核酸Ⅱ組，且Western blot結(jié)果顯示，p-PI3K和p-Akt表達較只用注射用核糖核酸Ⅱ處理組的表達明顯上升，p53的蛋白表達水平明顯下降。這些結(jié)果提示，注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)KG1a細胞凋亡與ROS、PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

綜上所述，在注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)人白血病KG1a細胞凋亡過程中，與ROS介導(dǎo)的PI3K/Akt信號通路密切相關(guān)。注射用核糖核酸Ⅱ是否還通過其他通路和方式誘導(dǎo)人白血病細胞凋亡還有待進一步探討。