芍藥苷促進糖尿病創(chuàng)面愈合

房志銳，陳 璐，李春曉，宋 敏，張璐莎，Joel Wake Coffie，張麗媛，馬璐璐，王 虹

(1. 方劑學教育部重點實驗室，天津市中藥藥理學重點實驗室，天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2. 天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，天津 301617)

糖尿病潰瘍(diabetes ulcers，DU)是由難愈性創(chuàng)面愈合引起的常見的糖尿病血管并發(fā)癥，其中因糖尿病導致截肢的患者中，并發(fā)DU的患者所占比例為84%[1-2]。有研究表明，清熱藥在DU總體藥物類別中所占比例為34%，成為所占比例最高的一類藥物，也成為治療DU的首選藥物。其中，清熱涼血藥在清熱藥中出現(xiàn)頻數(shù)最高，赤芍在清熱涼血藥中占大于30%的比例，使用頻率與玄參并列最高。赤芍，味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱涼血、散瘀止痛之功。《本草求真》載，“赤芍有散瘀行血之意，能于血中活滯，故凡腹痛堅積，血瘕疝痹，經(jīng)閉目赤，因于積熱而成者，用此則能涼血逐瘀”。可見，赤芍除具有清熱涼血之功外，尚兼有活血散瘀之效[3-4]。芍藥苷(paeoniflorin，PA)是赤芍重要的藥效物質基礎[5]，研究表明，其具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、緩解皮損癥狀等作用，且不良反應少[6-8]。但關于PA對糖尿病創(chuàng)面愈合的作用尚未見報道。本研究旨在通過建立糖尿病小鼠全層皮膚切除夾板模型，探討PA對糖尿病創(chuàng)面愈合的作用及其作用機制。

1 材料

1.1 細胞株人臍靜脈內皮細胞株HUVECs、小鼠成纖維細胞株NIH/3T3，均購自美國菌種保藏中心(ATCC)。

1.2 實驗動物36只SPF級健康♂糖尿病(BKS.Cg-Dock7m+/+Lepr db /JNju，db/db)小鼠，12只SPF級健康♂野生型(C57BL/6JNju,db/+)小鼠，8～12周齡，均由南京大學南京生物醫(yī)學研究所提供，許可證號：SCXK(蘇)2015-0001。實驗動物于天津市中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學放射工程研究所動物房中分籠飼養(yǎng)，自由進食，飼養(yǎng)溫度(22～25) ℃，相對濕度40%～60%。

1.3 藥物與試劑PA，購于成都德斯特生物科技有限公司，貨號DST170103-070，HPLC≥98%；內皮細胞培養(yǎng)基-2(endothelial cell growth medium-2，EGM-2)(貨號：CC-4147)、胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS)(貨號：CC-3156)，均購于瑞士Lonza公司；DMEM購于Biological Industrie公司；三溴乙醇(Avertin)、二甲基亞砜(DMSO)，均購于美國Sigma公司；注射用凝集素Lectin I、羊抗鼠Lectin I一抗、二抗DyLight?594抗羊IgG (H+L)，均購自美國Vector公司；BrdU細胞增殖檢測試劑盒(貨號：11647229001)，購自瑞士Roche公司。

1.4 儀器細胞恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；小型臺式離心機(美國Beckman公司)；多功能酶標儀(美國Molecula Device公司)；IncuCyte Zoom(美國ESSEN公司)；7500實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)HUVECs培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為EGM完全培養(yǎng)液，基礎培養(yǎng)基為EBM，加入5%的FBS，4 ℃存放。NIH/3T3成纖維細胞培養(yǎng)所用基礎培養(yǎng)基為DMEM，加入含10%的FBS、1%雙抗。細胞置于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，融合至80%～90%時進行傳代。

2.2 細胞活力分析采用MTS法進行細胞活力分析。細胞融合至80%時，以2.5×103個細胞每孔接種于96孔板中。置于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)12 h后，細胞分組，分為對照組(DMSO組，含0.1% DMSO)，給藥組(分別加入終濃度為0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1的PA)，每組6個復孔。給藥后24 h，每孔加入20 μL MTS。2 h后，于酶標儀波長490 nm測吸光度OD值。

2.3 細胞增殖能力分析采用BrdU摻入法進行細胞增殖能力分析。細胞融合至80%時，以2.5×103個細胞/孔接種于96孔板中。置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)12 h后，細胞分組同“2.2”，每組6個復孔。給藥后24 h，根據(jù)BrdU細胞增殖檢測試劑盒說明書進行后續(xù)步驟，每個樣品孔的吸光度由酶標儀在370 nm處測量，吸光度值直接與DNA合成量相關，從而與增殖細胞的數(shù)量相關。

2.4 細胞遷移能力分析采用劃痕法檢測遷移能力。細胞融合至80%時，以1×104個細胞/孔接種于96孔板中。置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)12 h后，將細胞分為對照組(DMSO組，含0.1% DMSO)和給藥組(加入終濃度為5、10、20、40 μmol·L-1的PA)。放入IncuCyte中進行細胞劃痕實驗。用96孔細胞劃痕器做細胞橫向劃痕，PBS緩沖液清洗除去劃痕時掉落的細胞碎片；按照分組加入對應的培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡40×下拍照記錄0 h；細胞放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再次進行拍照記錄；通過相差顯微鏡記錄劃痕之后細胞遷移，通過內皮細胞的劃痕面積(間隙寬度)的平均長度來確定遷移程度，計算公式：24 h遷移率/%=(A0 h-A24 h)/A0 h×100%，式中A代表劃痕面積。

2.5 細胞成管能力分析采用基質膠成管方法檢測細胞體外成管能力。Matrigel基質膠包被預冷的96孔板后，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。HUVECs細胞分為對照組(DMSO組，含0.1% DMSO)、給藥組(加入終濃度為10 μmol·L-1的PA)和VEGFA組(加入終濃度為0.1 mg·L-1的VEGFA)，以2×104個細胞/孔接種于基質膠預先包被的96孔板中。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)18 h后倒置顯微鏡拍照，使用ImageJ軟件分析成管結構的節(jié)點數(shù)。

2.6 qPCR檢測Ⅲ型膠原(Collagen Ⅲ)、纖維連接蛋白(Fibronectin)、α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)mRNA的表達NIH-3T3細胞融合至80%時，以2×105個細胞/孔接種于12孔板中。將細胞分為對照組(DMSO組，含0.1% DMSO)和給藥組(分別加入終濃度為1×10-5、2×10-5、4×10-5mol·L-1的PA)。給藥48 h后，使用TRIzol提取細胞RNA，逆轉錄合成cDNA,進行qPCR,檢測Collagen Ⅲ、Fibronectin、α-SMA mRNA的表達。Collagen Ⅲ 正向引物：5′-ACGTAAGCACTGGTGGACAG-3′,反向引物：5′-AGCTGCACATCAACGACATC-3′；Fibronectin正向引物：5′-CTACCCTGCAGCCTCTGCGC-3′，反向引物：5′-CCTCCCTGGCTCGGTCG-3′；α-SMA正向引物：5′-CCACCGCAAATGCTTCTAAGT-3′，反向引物：5′-GGCAGGAATGATTTGGAAAGG-3′。每組設置3個復孔，與對照組比較后，取2-ΔΔCt值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，分析相對表達量。

2.7 α-SMA細胞免疫熒光染色NIH-3T3細胞以5×104個/孔接種于12孔板中，將細胞分為對照組(DMSO組，含0.1% DMSO)和給藥組(含終濃度為10 μmol·L-1的PA)，每組設3個復孔，培養(yǎng)48 h后，對NIH-3T3細胞進行α-SMA細胞免疫熒光染色實驗。倒置熒光顯微鏡(×200)觀察染色的細胞，每孔觀察6個隨機視野，拍照并計數(shù)染色陽性的細胞。

2.8 糖尿病小鼠全層皮膚切除夾板模型的建立根據(jù)文獻方法，建立糖尿病小鼠全層皮膚切除夾板模型[9]。以15 g·L-1Avertin(16.5 mL·kg-1) 經(jīng)腹腔注射對小鼠行全身麻醉后取俯臥位，去除小鼠背部被毛。在小鼠背部中線使用生物活檢器向下按壓,制備直徑為6 mm的圓形全層皮膚切除傷口。用醫(yī)用黏合劑將硅膠夾板固定在傷口周圍，并以5-0縫合線縫合，然后將小鼠置于37 ℃電熱毯上直至蘇醒。在傷口處點涂慶大霉素后，用3M傷口敷料覆蓋傷口，每2 d更換1次。

2.9 實驗分組與給藥按照隨機雙盲的方法將糖尿病創(chuàng)面愈合模型小鼠分為3組：db/+模型組、db/db模型組、db/db芍藥苷組(db/db模型組+PA 10 mg·kg-1·d-1),每組10只。db/+模型組與db/db模型組，灌胃羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10 mL·kg-1，給藥組灌胃PA，每天1次，連續(xù)給藥16 d后取材。

2.10 HE和Masson染色觀察創(chuàng)面組織形態(tài)學變化連續(xù)給藥16 d后，取小鼠創(chuàng)面皮膚組織，4%多聚甲醛溶液固定，取石蠟組織切片進行HE和Masson染色,于光鏡下觀察創(chuàng)面皮膚組織形態(tài)學改變。

2.11 免疫熒光法檢測血管新生取石蠟組織切片進行免疫熒光染色。熒光計數(shù):隨機選取5個不同的糖尿病創(chuàng)面皮膚組織橫切面視野，以PS軟件(Photoshop 5)計數(shù)每個視野內毛細血管數(shù)量,血管新生以lectin+陽性細胞數(shù)表示。

3 結果

3.1 PA對糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合及一般指標的影響造模后16 d，與正常組相比，糖尿病小鼠各組各時間點創(chuàng)面愈合率均明顯減慢；正常組小鼠創(chuàng)面大多數(shù)接近完全愈合；而模型組糖尿病鼠仍有27%的未愈合創(chuàng)面，給藥組糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合率達到81%，且造模后8 d開始，愈合率在各時間點均高于模型組，明顯促進創(chuàng)面愈合，并持續(xù)到觀察終點(P<0.05)，見Fig 1A、1B。皮膚創(chuàng)傷后，各組間基礎體質量和血糖均無差異(Fig 2)。提示藥物干預對糖尿病小鼠體重和血糖沒有明顯影響。

3.2 PA對糖尿病小鼠創(chuàng)面周圍組織形態(tài)學的影響采用HE染色對造模后16 d小鼠創(chuàng)面組織新生肉芽組織進行分析。如Fig 1C所示，給藥組的新生肉芽組織厚度較厚，且表皮結構連續(xù)完整，可見大量的成纖維細胞增殖，膠原纖維生成較多，且排列較整齊。模型組肉芽組織厚度較薄，表皮結構不完整，僅有少量膠原纖維形成，并且排列較紊亂。Masson染色可將膠原蛋白染成深藍色，藍色越深代表膠原蛋白含量越多，可用于評價傷口處膠原沉積情況。PA組糖尿病小鼠傷口組織所染藍色深，創(chuàng)面膠原纖維排列整齊；模型組糖尿病小鼠傷口組織呈淺藍色，膠原稀疏，排列無序(Fig 1D)。

Fig 1 Effect of paeoniflorin on rate of wound healing and wound histomorphology in diabetic mice n=6)

A: The situation of wound healing in each group of diabetic mice at every two days; B: Quantification by the rate of wound healing of diabetic mice at each time point; C: The wound tissues of diabetic mice were stained with HE 16 days after surgery; D: The wound tissues of diabetic mice were stained with Masson16 days after surgery.*P<0.05 vs db/db model.

Fig 2 Effect of paeoniflorin on general indicators of diabetic mice n= 6)

A: The weight of each group of diabetic mice at each time point; B: The blood glucose of each group of diabetic mice at each time point, compared with model group.

3.3 PA對糖尿病小鼠創(chuàng)面組織周圍血管和毛細血管密度的影響給藥16 d，采集創(chuàng)面組織周圍血管的圖像(Fig 3A)，PA治療的毛細血管密度比CMC-Na治療更為明顯；倒置熒光顯微鏡下拍照觀察Lectin+細胞的分布和數(shù)量，以PS軟件計數(shù)每個視野內紅色熒光蛋白數(shù)量來評價毛細血管密度。糖尿病小鼠創(chuàng)面周圍組織Lectin+免疫熒光結果顯示(Fig 3C)，與模型組相比，PA治療組Lectin+紅色熒光表達更強、數(shù)量更多。結果顯示(Fig 3B)，給藥16 d PA治療組Lectin+細胞數(shù)目相比模型組明顯增多(P<0.01)

3.4 PA對HUVECs增殖、遷移、成管能力的影響采用HUVECs探究PA對細胞增殖、遷移和成管能力的影響。首先通過MTS和BrdU標記實驗，檢測不同濃度的PA對HUVECs增殖能力的影響，實驗結果顯示(Fig 4A、4B)，與對照組相比，各組細胞活性和增殖能力均無顯著性差異。提示PA干預對HUVECs增殖能力沒有明顯影響。其次，利用細胞劃痕實驗檢測PA對HUVECs遷移的影響，結果顯示(Fig 4C、4D)，加藥6 h后PA(10 μmol·L-1)組能夠明顯縮小細胞劃痕的寬度，與模型組相比，PA可以增強HUVECs遷移，促進細胞劃痕愈合(P<0.01)。體外Matrigel成管結果顯示(Fig 4E)，PA(10 μmol·L-1)誘導HUVECs體外成管節(jié)點明顯增多，與對照組相比，PA可以增強HUVECs成管能力(P<0.01)。

A: The image of the density of blood vessels around the wound tissues in diabetic mice; B: Quantification of Lectin immunofluorescence staining; C: Lectin immunofluorescence staining showed capillary density analysis of wound tissues in diabetic mice.**P<0.01vsdb/db model.

Fig 4 Effect of paeoniflorin on capacity of proliferation, migration and tube formation in HUVECs n=3)

A: MTS method was used to detect the effect of paeoniflorin on HUVEC activity; B: BrdU method was applied to detect the effect of paeoniflorin on HUVEC proliferation; C. The cell scratch test of HUVECs (×200); D: Quantitation of C; E: Matrigel analysis of the capacity of tube formation in HUVECs; F: Quantitation of E.**P<0.01vscontrol group.

3.5 PA對成纖維細胞增殖、遷移、分化和分泌能力的影響采用NIH/3T3成纖維細胞，探究PA對細胞增殖、遷移、分化和分泌能力的影響。通過MTS和BrdU標記實驗，檢測不同濃度的PA對NIH/3T3細胞增殖能力的影響，結果顯示(Fig 5A、5B)，與對照組相比，PA組細胞活性無差異，PA組細胞增殖能力明顯增加(P<0.05)。利用細胞劃痕實驗檢測PA對NIH/3T3細胞遷移的影響，結果顯示(Fig 5C、5D)，與模型組相比，PA(20 μmol·L-1)組能夠明顯縮小加藥10 h后細胞劃痕的寬度，可以增強成纖維細胞遷移，促進細胞劃痕愈合(P<0.01)。

Collagen Ⅲ、Fibronectin是細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的主要成分，本研究通過qPCR方法檢測PA加藥處理48 h后NIH/3T3中Collagen Ⅲ、Fibronectin的表達水平。結果顯示(Fig 6A、6B)，PA干預48 h后，Collagen Ⅲ mRNA的表達明顯增加(P<0.01)，F(xiàn)ibronectin mRNA的表達無差異。提示PA具有促進NIH/3T3細胞Collagen Ⅲ表達的作用。

Fig 5 Effect of paeoniflorin on capacity of proliferation and migration in NIH/3T3 n=6)

A: MTS method was used to detect the effect of paeoniflorin on NIH/3T3 activity; B: BrdU method was applied to detect the effect of paeoniflorin on NIH/3T3 proliferation; C: The cell scratch test of NIH/3T3 (×200); D: Quantitation of C.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

α-SMA是肌成纖維細胞的重要標志，肌成纖維細胞由成纖維細胞轉化而來，在組織器官的損傷、修復和重塑過程中具有重要作用。實驗結果顯示(Fig 6C、6D)，PA能提高α-SMA的表達量和熒光強度。提示PA能夠提高成纖維細胞的轉化能力，促進創(chuàng)面損傷修復。

4 討論

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，PA可以促進糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合，促進肉芽組織增厚、膠原沉積和增加組織毛細血管密度，提示PA能夠通過促進創(chuàng)面組織ECM的沉積和血管新生，為組織修復提供良好的基礎。體外實驗結果提示，PA促進糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合，可能是通過提高HUVECs遷移和成管能力，提高成纖維細胞增殖、遷移、分泌和向肌成纖維細胞轉化的能力來實現(xiàn)。

糖尿病引起的一系列血管、神經(jīng)和代謝異常，使得糖尿病皮膚較正常皮膚更易受到損傷，糖尿病傷口愈合緩慢，組織難以得到有效修復。血管新生受損，組織損傷局部供血不足是糖尿病傷口難愈合的主要表現(xiàn)之一[10-11]。新生血管可改善傷口處微循環(huán)，為損傷修復提供必要的氧氣和營養(yǎng)，在糖尿病創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮重要作用。本研究表明，PA明顯增加糖尿病小鼠創(chuàng)面處血管新生數(shù)目。體外實驗也進一步證實，PA無明顯促進內皮細胞增殖的作用，但可以明顯促進內皮細胞的遷移和成管，提示PA具有很強的促血管生成作用。

肉芽組織形成是創(chuàng)面修復增殖期的主要階段，成纖維細胞是其主要組成細胞。在創(chuàng)面愈合過程中，成纖維細胞向能夠分泌大量的膠原且表達α-SMA的肌成纖維細胞轉化。肌成纖維細胞具有收縮作用，可以加速創(chuàng)面收縮，在創(chuàng)面修復過程中起著更為重要的作用[12]。糖尿病下的高糖環(huán)境、糖基化終末產(chǎn)物、氧化應激等，均可阻礙創(chuàng)面肌成纖維細胞的形成，從而影響肉芽組織的生成和創(chuàng)面的愈合[13-14]。本研究表明，PA可以提高成纖維細胞增殖和遷移的能力，促進肌成纖維細胞標志α-SMA的表達，提示PA可以促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，加速創(chuàng)面收縮。成纖維細胞是創(chuàng)面重塑過程中的主要修復細胞，能夠通過快速增殖和合成膠原等，促進皮膚損傷修復。有研究表明，糖尿病環(huán)境下，皮膚組織中成纖維細胞增殖減弱，進而影響創(chuàng)面ECM合成，創(chuàng)面愈合遲緩[14]。本實驗結果表明，PA可以升高ECM相關基因的表達，提示PA能促進ECM的沉積。

Fig 6 Effect of paeoniflorin on expression of collagen Ⅲ, fibronectin and α-SMA in fibroblasts n=3)

A: qPCR assay for the effect of paeoniflorin on the expression of collagen Ⅲ, fibronectin, α-SMA mRNA in NIH/3T3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group; B: Fluorescent protein intensity of α-SMA(×200).

綜上所述，PA可以通過促進糖尿病小鼠創(chuàng)面血管新生和肉芽組織形成，加快糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合速度，并提高愈合質量，起到了創(chuàng)面損傷修復的效果，為PA的臨床應用提供了新的實驗依據(jù)，也為糖尿病創(chuàng)面愈合治療提供了新的思路。