DERL1對人乳腺癌細胞ZR-75-1遷移和侵襲的影響

胡 露，李洪忠，萬敬員

(1. 重慶醫(yī)科大學藥學院,重慶 400016；2. 重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院分子腫瘤學與表觀遺傳學實驗室,重慶 400016)

乳腺癌是影響全世界女性健康最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)最新統(tǒng)計，其發(fā)病率在全世界女性腫瘤疾病中列第一位[1]。雖然現(xiàn)臨床上可以采用外科手術結合放射性療法、化學療法以及靶向治療等，在一定程度上有效地控制早期乳腺癌，但是難治性乳腺癌，特別是轉移性乳腺癌的預后卻不容樂觀。因此，探討乳腺癌發(fā)生轉移的分子機制顯得尤其關鍵。

DERL1(Der1-like domain family，member 1)是一種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)降解相關的蛋白，其參與ER中錯誤折疊的蛋白質(zhì)的釋放過程，并將該蛋白質(zhì)逆轉運到細胞質(zhì)中[2]。DERL1在非小細胞型肺癌[3]、結腸癌[4]和乳腺癌[5]中過度表達，并發(fā)揮重要作用。Wang等[5]研究表明，DERL1表達與腋窩淋巴結轉移之間有明顯關聯(lián)，表明DERL1可能參與侵襲性腫瘤生長或轉移，但其對乳腺癌侵襲和轉移的作用還研究甚少。本研究通過將DERL1過表達及干擾質(zhì)粒轉入人乳腺癌ZR-75-1細胞，探討DERL1對ZR-75-1細胞遷移和侵襲能力的影響及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人乳腺癌細胞ZR-75-1，來源于美國ATCC細胞庫，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。

1.1.2試劑 脂質(zhì)體轉染試劑Lipofectamine 2 000，購自美國Invitrogen；DERL1過表達(DERL1)及干擾(DERL1 siRNA)質(zhì)粒，購自賽業(yè)生物科技有限公司；胎牛血清，購自以色列BI公司；RPMI 640培養(yǎng)基，購自美國HyClone公司；DERL1、E-cadherin、β-actin引物序列，均由生工生物工程有限公司合成；TRIzol、實時熒光定量PCR試劑盒，購于日本TaKaRa公司；兔抗人DERL1抗體，購自美國Novus公司；兔抗人鈣黏附蛋白E(E-cadherin)抗體，購自美國CST公司；熒光二抗羊抗兔IgG，購自美國Invitrogen。

1.1.3儀器 FORMA311型CO2細胞培養(yǎng)箱、PLF-276型-80 ℃低溫冰箱、MIRO 21R型高速低溫離心機(美國Thermo公司)；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；CFX型定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Eclipse Ti型熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞干預分組 細胞分4組：(1)DERL1過表達對照組(control-1)：轉入DERL1過表達對照質(zhì)粒；(2)DERL1過表達組(DERL1)：轉入DERL1過表達質(zhì)粒；(3)DERL1干擾對照組(control-2)：轉入DERL1干擾對照質(zhì)粒；(4)DERL1干擾組(si-DERL1)：轉入DERL1干擾質(zhì)粒。

1.2.2細胞干預(質(zhì)粒轉染) 待細胞密度在6孔板中處于80%-90%后，按Lipofectamine 2000試劑說明書進行轉染操作。6 h后換為含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，于CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用于后續(xù)實驗。

1.2.3細胞劃痕愈合實驗 取各組細胞分別制成單細胞懸液，接種于6孔板中，置于CO2細胞培養(yǎng)箱中，待細胞長滿后，每孔用無菌牙簽劃一道粗細均勻的豎痕，于倒置顯微鏡下采集細胞0 h時劃痕的初始狀態(tài)照片后，放回CO2細胞培養(yǎng)箱中，24 h后，再次拍攝各組細胞劃痕狀態(tài)。用ImageJ軟件計算劃痕面積，與相應對照組進行組間比較。細胞遷移率/%=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.2.4Transwell實驗 用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基將各組細胞制備成單細胞懸液后，分別以1×105個/孔加入鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室(置于24孔板)中。每個小室下層的孔中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，于CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，取出小室，用結晶紫染色后，用棉簽輕輕擦去上室中未遷移的細胞，于倒置顯微鏡下對膜底細胞隨機采集圖片，隨后用ImageJ軟件計算侵襲細胞數(shù)。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測 用TRIzol提取不同干預組細胞總RNA，根據(jù)反轉錄試劑盒說明書，按20 μL體系反轉錄RNA生成cDNA。進一步以獲得的cDNA為模板，對相應的目的基因進行qPCR擴增。E-cadherin上游引物：5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′，下游引物：5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′；β-actin上游引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′；DERL1上游引物5′-TCGGACATCGGAGACTGGTT-3′，下游引物：5′-GGCAGTGATTGGCCTCCAAA-3′。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法表示相對表達量。

1.2.6細胞免疫熒光實驗 將各組細胞分別接種于24孔板中，置CO2細胞培養(yǎng)箱中24 h后，取出用95%乙醇固定1 h，隨后用0.05% Triton X-100通透20 min，PBS洗滌后，加入E-cadherin一抗(1 ∶100)，4 ℃過夜；PBS清洗后，加入羊抗兔熒光標記二抗避光孵育1 h，PBS洗滌3次后，與DAPI避光孵育15 min，然后用PBS洗滌3次，在熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.7統(tǒng)計學分析 用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計處理，兩組間比較使用t檢驗。

2 結果

2.1 質(zhì)粒干預后細胞中DERL1的表達水平qPCR檢測結果顯示(Fig 1)，與相應對照組相比，DERL1過表達質(zhì)粒能使ZR-75-1細胞中DERL1的mRNA水平明顯升高(P<0.01)，DERL1干擾質(zhì)粒能使ZR-75-1細胞中DERL1的mRNA水平明顯降低(P<0.01)，表明DERL1過表達及干擾質(zhì)粒成功轉入細胞中，可用于后續(xù)實驗。

Fig 1 Expression of DERL1 in each group of

**P<0.01vscontrol-1;##P<0.01vscontrol-2.

2.2 DERL1對ZR-75-1遷移能力的影響Fig 2的劃痕愈合實驗結果顯示，24 h時，與相應對照組相比，DERL1過表達組ZR-75-1細胞遷移率明顯升高(P<0.05)；DERL1干擾組細胞的遷移率明顯降低(P<0.05)。表明DERL1對 ZR-75-1細胞遷移有促進作用。

Fig 2 Effect of DERL1 overexpression (A) and DERL1 interference (B) on migration of ZR-75-1 cells (× 100)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2.3 DERL1對ZR-75-1侵襲能力的影響Fig 3的Transwell結果顯示，48 h后，DERL1過表達組穿膜細胞數(shù)較對照組明顯增多(P<0.05)，DERL1干擾組穿膜細胞較對照組明顯減少(P<0.05)。表明DERL1可促進 ZR-75-1細胞的侵襲。

Fig 3 Effect of DERL1 overexpression (A) and DERL1 interference (B) on invasion of ZR-75-1 cells (×100)

**P<0.01vscontrol.

2.4 DERL1對ZR-75-1細胞形態(tài)的影響為了說明DERL1對ZR-75-1細胞的形態(tài)是否具有影響，本實驗觀察了用DERL1過表達及干擾質(zhì)粒轉染ZR-75-1細胞48 h后，細胞的形態(tài)變化。如Fig 4所示，與對照組相比，DERL1過表達組細胞形態(tài)由緊密排列的鵝卵石狀變?yōu)榕帕兴缮⒌募忓N形間質(zhì)樣，轉入DERL1干擾質(zhì)粒后，細胞變回緊密排列的鵝卵石狀。提示DERL1可能促進ZR-75-1細胞的形態(tài)發(fā)生上皮間質(zhì)轉化。

Fig 4 Effect of DERL1 on cell morphous of ZR-75-1 cells(×100)

2.5 DERL1對ZR-75-1細胞中E-cadherin mRNA和蛋白表達的影響qPCR和細胞免疫熒光結果顯示(Fig 5)，DERL1過表達組中E-cadherin mRNA和蛋白水平低于相應對照組(P<0.05)；DERL1干擾組中E-cadherin mRNA和蛋白表達高于相應對照組(P<0.05)。表明DERL1能抑制ZR-75-1細胞中E-cadherin mRNA和蛋白的表達水平。

3 討論

DERL1是蛋白編碼基因，由該基因編碼的蛋白質(zhì)DERL1是derlin家族的成員，該家族成員參與ER錯誤折疊蛋白質(zhì)的錯位，并介導蛋白質(zhì)從ER腔逆轉移到胞質(zhì)中[6-7]。ER的主要功能是合成、折疊、運輸以及修飾分泌蛋白和跨膜蛋白，當細胞處于缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏和細胞毒物作用等情況時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)出現(xiàn)錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白過度堆積、固醇等水平失調(diào)而啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。在ER應激的早期階段，細胞生長得到促進。然而，如果這些不利的刺激持續(xù)存在，延長的ER應激將誘導細胞凋亡。Wang等[5]研究表明，DERL1在乳腺癌中高表達，且DERL1可保護乳腺癌細胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡，細胞凋亡是腫瘤轉移級聯(lián)中的限速過程，這可能賦予癌細胞轉移特性。Pi等[8]發(fā)現(xiàn)，DERL1在頭頸部鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck，SCCHN)的組織和細胞中表達升高，且DERL1的表達與頸淋巴結轉移、復發(fā)和臨床分期明顯相關，在SCCHN細胞中，敲低DERL1的表達可促進細胞凋亡，抑制細胞的增殖和轉移。Wu等[9]研究表明，膀胱癌組織和細胞中DERL1均高表達，具有DERL1陽性表達的患者的總存活率低于陰性表達的患者，并且發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細胞中，干擾DERL1的表達可以逆轉上皮間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)進展，抑制細胞的遷移和侵襲。

Fig 5 Effect of DERL1 on expression of E-cadherin mRNA and protein in ZR-75-1 cells

為探究DERL1對人乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響，本實驗用DERL1過表達及干擾質(zhì)粒，對人乳腺癌細胞ZR-75-1中DERL1的表達進行干預后，檢測各組細胞的遷移和侵襲能力。結果顯示，與對照組相比，DERL1過表達可明顯增加ZR-75-1細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)目，DERL1表達降低后，細胞的遷移率和侵襲細胞數(shù)均明顯降低，表明DERL1能促進人乳腺癌細胞ZR-75-1的遷移和侵襲。

腫瘤細胞可通過細胞外基質(zhì)降解、新生血管生成和免疫逃避等機制，發(fā)生侵襲和轉移，其中EMT發(fā)揮十分重要的作用。EMT是指緊密連接的上皮細胞在某些生理或病理條件下，細胞間的連接與極性喪失，轉化為紡錘形樣間質(zhì)細胞的生物學過程，其在胚胎發(fā)育、組織重建和器官纖維化中十分關鍵。后研究發(fā)現(xiàn)，上皮細胞通過EMT可獲得降解細胞外基質(zhì)、抵抗細胞凋亡、進行遷移與侵襲等間質(zhì)表型的能力，表明其在腫瘤侵襲轉移的發(fā)生、發(fā)展中作用關鍵[10]。EMT的發(fā)生涉及多種分子機制，其中E-cadherin是一種鈣依賴性的跨膜蛋白，細胞間黏附、細胞上皮表型的喪失與E-cadherin表達的降低有關[11-12]，其表達的降低被認為是EMT發(fā)生的標志[13]。Markiewicz等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與E-cadherin表達正常的乳腺癌患者相比，E-cadherin缺失的患者具有更高比例的間質(zhì)型的腫瘤細胞。Yu等[12]研究顯示，E-cadherin在上皮細胞癌中發(fā)揮著抑制癌細胞遷移和侵襲的作用。Pi等[8]和Wu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在SCCHN細胞和膀胱癌細胞中，抑制DERL1的表達后，兩種細胞中E-cadherin的表達水平均明顯上調(diào)。

為探究DERL1促進乳腺癌細胞遷移和侵襲的分子機制，本實驗觀察了ZR-75-1細胞轉染DERL1過表達及干擾質(zhì)粒后的形態(tài)變化，并檢測了各實驗組中E-cadherin mRNA和蛋白的表達情況。結果顯示，與對照組相比，DERL1過表達組細胞形態(tài)由鵝卵石形上皮樣轉化為紡錘形間質(zhì)樣，細胞中E-cadherin mRNA和蛋白的表達量明顯下降；干擾DERL1的表達后，細胞形態(tài)由紡錘樣轉變回緊密排列的鵝卵石狀上皮樣，且細胞中E-cadherin mRNA和蛋白的表達量明顯上升。由此推測，DERL1可能通過下調(diào)E-cadherin的表達水平，促進乳腺癌細胞的EMT，從而促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲。但是DERL1下調(diào)E-cadherin的信號通路機制有待進一步研究。

(致謝：本實驗于重慶醫(yī)科大學生化與分子藥理重點實驗室完成，特別感謝李海琳和曾穎靚的幫助。)