多胺代謝與自噬在增齡大鼠心臟中的變化及外源性精脒對衰老心臟自噬的影響

吳飛翔，陳俞翰，李邵琦，王 舉，林 巖，王俊瑩，張 昊，于 雪，趙雅君

(1. 哈爾濱醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081；2. 齊齊哈爾醫學院基礎醫學院病理生理學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

心臟衰老的機制復雜，近年來，自噬在心臟衰老中的作用備受關注[1]。自噬是在多種基因相互作用下完成的復雜細胞過程，是維持細胞內環境穩態的重要機制。每種自噬相關基因(ATG)負責調控自噬體啟動與形成的不同階段，其中ATG12-ATG5綴合物對自噬的中心事件自噬體的形成至關重要，ATG7是活化ATG8(即自噬標志性蛋白LC3)和ATG12的關鍵上游分子，ATG7的活化與ATG12-ATG5綴合物形成均是自噬的重要調控環節[2]。p16基因是一種抑癌基因，也是細胞衰老的重要調控基因。p16與pRb-cyclinD1-CDK4形成G1期檢查站點，抑制細胞周期G1-S期的轉化。導入p16基因的細胞可出現衰老表型[3]。目前，在多種組織器官衰老的模型中發現，自噬減少與疾病發展和壽命縮短密切相關，而增強細胞自噬可以延長壽命[4]。但是，自噬在心臟衰老中的作用報道較少，有待于進一步研究。

多胺(polyamine，PAs)包括精胺(spermine，SP)、精脒(spermidine，SPD)等，廣泛存在于真核生物組織細胞內，具有促進細胞增殖、抗炎、抗氧化、抗凋亡、誘導自噬等廣泛生物學作用[5]。細胞內多胺水平對維持細胞穩態非常重要，細胞內多胺水平受合成、分解及轉移出胞等多種機制的精確調控。鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)為多胺合成代謝限速酶，精脒/精胺乙酰轉移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferas，SSAT)為多胺分解代謝限速酶[5]。已有文獻報道，多胺代謝失衡導致許多細胞過程受損，引起組織器官損傷；而提供外源性精脒對多種模式生物，包括小鼠、大鼠的衰老及衰老相關疾病具有保護作用[6]。但是年齡依賴的大鼠心臟多胺代謝與自噬的變化規律及二者的關系，目前還不清楚。本研究對此進行探討，同時進一步觀察外源性精脒對老齡大鼠心肌細胞自噬、氧化應激及細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Wistar大鼠，♂，清潔級，購自哈爾濱醫科大學附屬第二臨床醫學院動物實驗中心，動物生產許可證號：SCXK(黑)2013-001。飼養條件：給予充足水和標準飼料，維持室溫(20～22) ℃，并保持光照充足。青年組鼠為3月齡，老年組鼠為22～24月齡，精脒組鼠為腹腔注射精脒6周的22～24月齡大鼠。

1.2 試劑精脒(Sigma公司)；抗GAPDH抗體(10494-1-AP)、抗p62/SQSTM1抗體(18420-1-AP)、抗p16抗體(10883-1-AP)、抗ATG5抗體(10181-2-AP)，均購自Proteintech公司；抗LC3-Ⅰ/Ⅱ抗體(#4108)、抗ATG7抗體(#8558)購自Cell Signaling Technology公司；抗ODC抗體(sc-33539)、抗SSAT抗體 (sc-67159)購自Santa Cruz公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0006C)、超氧化物陰離子熒光探針二氫乙錠(dihydroethidium，DHE)試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；TUNEL試劑盒(11684817910)，購自Roche公司。

1.3 儀器倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；H-600型透射電子顯微鏡(日本日立)；MCO-17AI CO2培養箱(日本SANYO)；電泳儀、電泳槽(美國Bio-Rad)；FluorChemR化學發光儀(美國Thermo公司)；S-1300-U凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術公司)；Fluoview FV1000熒光顯微鏡(日本奧林巴斯光學有限公司)。

1.4 動物實驗隨機取3、6、12、24月齡Wistar ♂大鼠(n=12)，應用水合氯醛(300 mg·kg-1)麻醉大鼠，同時進行肝素化處理(1 000 IU·kg-1)，大鼠仰臥位固定于手術臺上，胸前區備皮，開胸后迅速取出心臟，冷PBS沖洗出心臟殘余血液，拭干心臟并稱重，取左心室肌組織用于免疫印跡分析。另一組實驗，隨機取3月齡Wistar ♂大鼠為青年組(Young組，n=6)；24月齡♂大鼠為老年組(Old組，n=6)；24月齡♂大鼠每天腹腔注射精脒(10 mg·kg-1)，連續6周，設為精脒給藥組(SPD組，n=6)。大鼠麻醉后，摘取心臟稱重用于后續實驗。

1.5 免疫印跡法檢測蛋白表達取各組大鼠左心室肌組織，液氮中研磨后，加入含1% PMSF的裂解液，制成心肌組織勻漿，4 ℃、1 500×g離心15 min，取上清，BCA法測定蛋白含量。經SDS-PAGE分離目的蛋白，將蛋白轉移到PVDF膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育一抗4 ℃冰箱過夜；TBST洗膜3次后，加入二抗室溫孵育2 h；TBST清洗3次，加入ECL發光試劑顯色成像，分析條帶密度。

1.6 HE染色取大鼠左心室肌組織(厚度小于0.5 cm)在4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，石蠟包埋，依次脫蠟、水化、蘇木精與伊紅(HE)染色、脫水、透明、封片，制成HE染色切片。光學顯微鏡下觀察心肌形態結構。隨機選取8個視野，采用Image-Pro Plus軟件進行心肌細胞橫截面積測量。

1.7 TUNEL分析取上述方法制備的石蠟包埋的心肌組織切片，采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡。按試劑盒說明書操作，光鏡下，凋亡的心肌細胞核染成棕褐色，每張切片隨機取5個以上的高倍視野，計數不少于200個心肌細胞核，計算凋亡指數(apoptosis index，AI)/%=陽性細胞數/(陽性細胞核數+陰性細胞數)×100%。

1.8 DHE熒光探針測定心肌細胞ROS生成取制備好的心肌組織冰凍切片，加入DHE(5 μmol·L-1)工作液到待染心肌冰凍切片上，37 ℃避光孵育30 min，用PBS洗滌細胞3次，在熒光顯微鏡下觀察ROS的熒光強度。

1.9 透射電子顯微鏡觀察心肌超微結構及自噬小體形成取大鼠左心室心肌組織1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm，置于2.5%戊二醛磷酸緩沖液中，4 ℃固定24 h以上。常規脫水，透明，包埋并染色，制成50～70 nm超薄切片，在透射電鏡下觀察心肌超微結構變化及心肌細胞內自噬小體的生成，并拍照。

2 結果

2.1 大鼠心肌ODC、SSAT、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白表達的增齡性變化Western blot檢測3、6、12、24月齡大鼠左心室肌組織中心肌多胺合成代謝關鍵酶ODC與多胺分解代謝關鍵酶SSAT的蛋白表達，以及自噬相關蛋白p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達。Fig 1結果顯示，ODC呈年齡依賴的表達下降，SSAT呈年齡依賴的表達增加。與3月齡比較，24月齡大鼠心肌組織ODC蛋白表達明顯下降(P<0.05)，SSAT蛋白表達明顯增多(P<0.05)。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達比值也呈年齡依賴地下降，p62表達呈年齡依賴性增加。與3月齡比較，24月齡心肌組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯下降(P<0.01)，p62蛋白表達明顯增多(P<0.01)。

2.2 年齡依賴的大鼠心肌多胺代謝變化與細胞自噬水平變化的相關性分析如Fig 2所示，年齡依賴的(3、6、12、24月齡)大鼠心肌ODC表達與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈明顯正相關(r2= 0.338 4，P<0.05)，與p62表達呈明顯負相關 (r2= 0.386 6，P<0.05)；SSAT蛋白表達與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈明顯負相關(r2= 0.344 4，P<0.05)，與p62表達呈明顯正相關(r2= 0.388 6，P<0.05)。

2.3 外源性多胺對老齡大鼠心肌細胞自噬的影響透射電鏡檢測心肌超微結構變化及心肌細胞自噬小體。Fig 3結果顯示，青年組心肌肌絲排列整齊、肌節結構清晰，肌絲間線粒體排列緊密，嵴清晰、膜結構完整、基質致密，并可見自噬小體，未見脂褐素顆粒沉積。老年組大鼠心肌肌絲排列較整齊，線粒體基質密度下降、部分線粒體可見腫脹甚至呈空泡變性，可見脂褐素顆粒沉積，未見雙層膜的自噬體；精脒干預組肌絲排列整齊，線粒體基質致密，脂褐素顆粒少見，自噬小體形成增多。大鼠心肌組織中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62、ATG5和ATG7表達結果顯示(Fig 4)，與青年組相比，老年組心肌p62蛋白表達明顯增加(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及ATG5、ATG7蛋白表達明顯減小(P<0.05)；給予外源性精脒處理的老齡大鼠心肌(SPD組)p62蛋白表達明顯減少(P<0.05)，LC3Ⅱ/Ⅰ、ATG5和ATG7蛋白表達明顯增加(P<0.05)。

Fig 1 Expression of ODC, SSAT, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and p62 protein in cardiac tissues from 3-, 6-, 12-

*P<0.05,**P<0.01vs3 months

Fig 2 Relationship between expression of ODC and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ (A) and ODC and p62 (B); and expression of SSAT and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio (C), and SSAT and p62 (D) in cardiac tissues from 3-, 6-, 12- and 24-month-old rats by scatter plots (n=12)

Fig 3 Effect of SPD on ultrastructure and autophagosome in myocardium of aged rats (×10 000)

The left ventricular ultrastructure was observed by transmission electron microscopy.

Fig 4 Effect of SPD on autophagy in myocardium in aged rats n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsyoung group;#P<0.05,##P<0.01vsold group

Fig 5 Expression of p16 protein measured by Western blot n=6)

*P<0.05vsyoung group;##P<0.01vsold group

3 討論

本研究結果顯示，隨著年齡增加，多胺合成代謝關鍵酶ODC表達下調，多胺分解代謝關鍵酶SSAT表達上調，這將會導致心肌多胺總水平降低。細胞內的多胺具有促進細胞增殖、分化、調控細胞內鈣、抗炎、抗氧化等廣泛的生物學作用，對細胞穩態的維持非常重要[5]。我們前期研究發現，適度運動訓練通過上調老齡大鼠心肌多胺合成代謝，維持心肌多胺總水平，恢復了老年大鼠心肌對缺血預適應刺激的敏感性[6]。因此，我們推測，由多胺代謝失衡導致的心肌多胺池耗損可能參與了心臟衰老過程。Nishimura等[7]檢測3、10和26周齡的♀小鼠14種不同組織中的多胺含量，發現14種組織中，有11種組織中的精脒水平降低。研究顯示，隨著年齡增加，組織器官多胺水平降低，ODC活性也呈相同下降趨勢，相反，增殖旺盛的組織細胞ODC活性增加，多胺水平增加[8]。因此，多胺可能在心臟衰老及衰老相關心血管疾病中發揮重要作用。

微管相關蛋白輕鏈1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)是酵母ATG8蛋白的哺乳動物同源體，有I和II兩種形式。LC3-Ⅰ定位于胞質，LC3-Ⅱ定位于自噬體的雙層膜上。自噬發生時，自噬體與溶酶體融合，LC3-Ⅱ被溶酶體中的水解酶降解，因此，LC3-Ⅱ含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值能夠反映自噬活性。p62作為適配子蛋白，在細胞內誘導鑲嵌有LC3的自噬體到溶酶體，將其吞噬并清除，與底物結合的p62也被蛋白水解酶降解，p62水平升高通常被認為是自噬活性受到抑制的標志[1]。本研究觀察到，3、6、12、24月大鼠心肌LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈年齡依賴性下降，p62蛋白表達呈年齡依賴性的增加，說明隨著年齡增加，大鼠心肌自噬水平下調。我們同時觀察到，3、6、12、24月大鼠心肌的多胺代謝合成代謝關鍵酶ODC蛋白表達與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈正相關，與p62蛋白表達呈負相關；多胺分解代謝關鍵酶SSAT表達與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈負相關，與p62蛋白表達呈正相關。近期已有研究證實，心肌細胞依賴于包括自噬的線粒體質量控制機制維持細胞活力, 自噬能力下降是心臟衰老的重要機制之一[1]。本研究也證實，衰老大鼠心肌自噬水平隨著年齡增加而降低，同時， 衰老心肌自噬功能下降可能與多胺代謝的增齡性變化存在內在聯系，二者可能相互作用，共同促進了心臟老化進程。

A: Representative left ventricle tissue sections stained by HE (×400), and quantification of the cross-section of cardiomyocytes; B: Nuclei with brown staining indicate TUNEL-positive cells (×400), and apoptosis rate in myocardial cells; C: ROS production was detected by DHE fluorescence staining (×400), and ROS levels in myocardial cells.*P<0.05,**P<0.01vsyoung group,#P<0.05vsold group.

我們給予老年24月齡大鼠補充外源性精脒處理6周，發現精脒能明顯抑制衰老誘導的心肌LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ATG5及ATG7蛋白表達下調，以及p62表達上調，增加衰老心肌細胞自噬小體形成，提示精脒能夠促進衰老大鼠心肌細胞自噬。此外，研究發現，精脒處理能明顯抑制24月齡大鼠心臟p16蛋白表達，降低衰老誘導的心肌細胞橫截面積增大、心肌細胞凋亡及心肌ROS生成，提示精脒具有延緩大鼠心臟的老化作用。

目前廣泛認可的觀點是氧化應激及線粒體功能障礙是心臟衰老的重要機制。線粒體是產生ROS的主要場所，線粒體功能障礙導致ROS產生增加，過量產生的ROS破壞核及線粒體DNA、蛋白質、脂質等，導致線粒體受損，又進一步促進ROS的生成，形成的惡性循環導致細胞凋亡[9]。衰老細胞中，過量生成的ROS也參與調控自噬相關蛋白，導致心臟的選擇性自噬功能不足，促進心臟衰老[10]。此外，在衰老的心臟，殘余健康的心肌細胞會發生代償性肥大，以維持相對正常的心臟功能[10]。目前，無論在植物還是在動物模型中都有報道精脒與精胺具有廣譜的抗氧化功能[11]。我們前期研究也顯示，外源性多胺能通過增加肝臟與心臟的抗氧化能力，延緩自然衰老大鼠的老化[12]。近年來學者們在多種屬、多器官的研究證實，精脒通過誘導自噬，發揮抗衰老及衰老相關疾病的作用。Eisenberg等[13]證實，精脒通過誘導自噬，延長酵母、果蠅和蠕蟲的壽命；喂食精脒的小鼠，壽命明顯延長，精脒通過促進小鼠心肌細胞自噬及線粒體自噬，增強了衰老心肌線粒體呼吸功能，進而抑制老年小鼠心臟舒張功能的下降。我們前期應用蛋白質組學的研究發現，精胺、精脒通過影響老年大鼠心肌參與免疫反應、脂質代謝、凝血反應和谷胱甘肽代謝通路上的蛋白質分子，抑制老年大鼠心臟的病理改變[14]。因此，我們有理由認為本研究中外源性精脒可能是通過抗氧化、誘導自噬，發揮抗大鼠心臟老化作用。

總之，本研究證明，隨著年齡增加，大鼠心肌多胺合成代謝下調、分解代謝上調、細胞自噬能力下降；多胺分解代謝與細胞自噬呈明顯的負相關；外源性多胺可通過抗氧化、誘導自噬，延緩大鼠心臟老化。本研究為開發新的抗心臟衰老藥物，進而降低衰老相關心血管疾病發生率及死亡率提供了理論基礎。

(致謝: 本實驗在哈爾濱醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室實驗室完成，對本實驗做出貢獻的所有人員表示衷心的感謝！)