ERK抑制劑U0126通過下調(diào)cyclin D1與survivin蛋白表達抑制乳腺癌細胞增殖

田繼華，常思佳，郭海秀，冀 賀，王艷紅

(山西醫(yī)科大學微生物學與免疫學教研室，山西 太原 030001)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居高不下，并且呈年輕化趨勢，但病因尚未完全清楚[1]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個十分復雜的過程，癌細胞的突變、增殖、細胞程序性死亡都參與其中。大量研究發(fā)現(xiàn)，cyclin D1[2]與survivin蛋白[3]參與腫瘤的增殖和抵抗凋亡，促進腫瘤細胞的增殖。ERK通路是目前研究較多的，與腫瘤細胞增殖密切相關(guān)的信號通路，ERK的過度激活在口腔癌、黑色素瘤、乳腺癌等許多人類癌癥中均有發(fā)現(xiàn)[4]。本研究以人乳腺癌細胞株為研究對象，觀察ERK抑制劑U0126對乳腺癌細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響，并通過檢測cyclin D1及survivin蛋白表達探討其具體的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑 MCF7完全培養(yǎng)液、L-15培養(yǎng)基，由中國科學院干細胞庫提供；U0126、p44/42 MAPK(ERK1/2)抗體、phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2)(Thr202/Tyr204)抗體，均購于美國Cell Signaling Technology公司；抗cyclin D1(H-295)、GAPDH、survivin、cleaved caspase-3抗體，均購自美國Santa Cruz Biotechnology；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞DNA含量檢測試劑盒(細胞周期)、全蛋白抽提試劑盒(KGP250)、磷酸化蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2細胞株 人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB231，由中國科學院干細胞庫提供。

1.1.3儀器 HEPA-CLASS100三氣組織培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Wellscan MK3酶標儀(芬蘭雷勃儀器廠)；ESP ELITE型流式細胞儀(美國COULITER公司)；Bio-Rad GelDoc EZ凝膠成像系統(tǒng)、Quantity One分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB231分別用含10%胎牛血清(FBS)的MCF7完全培養(yǎng)液、L-15培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。將已傳代2～3次，融合度達80%的細胞換用無血清培養(yǎng)基24 h，使細胞進入靜止期,然后進行細胞分組干預：MCF-7組(MCF7完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，含10% FBS)、MCF-7+U0126組(MCF7完全培養(yǎng)液中加入U0126，調(diào)整U0126濃度為5 μmol·L-1)、MDA-MB231組(L-15培養(yǎng)基+10% FBS常規(guī)培養(yǎng))、MDA-MB231+U0126組(L-15培養(yǎng)基+10% FBS+ U0126，調(diào)整U0126濃度為5 μmol·L-1)。

1.3 MTT法檢測細胞增殖將MCF-7、MDA-MB231單細胞懸液接種于2個96孔培養(yǎng)板，1×103～1×104個細胞每孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分組，每組設6個復孔；U0126分別干預24、48 h，在干預結(jié)束前4 h，每孔加入MTT 20 μL；棄掉培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，室溫振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；酶標儀檢測各孔492 nm波長處吸光度值(OD值)，記錄結(jié)果，實驗重復3次。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期將培養(yǎng)瓶中細胞消化，制成單細胞懸液，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，5×105個細胞/孔，培養(yǎng)24 h；將細胞分組后，培養(yǎng)24 h收集各孔細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，將細胞濃度調(diào)整為1×108·L-1；取1 mL細胞懸液，離心去上清，加入70%預冷的乙醇1 mL，4 ℃固定過夜；用PBS洗去固定液，離心后加100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min；再加入400 μL PI進行染色混勻，4 ℃避光30 min；上流式細胞儀檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處熒光。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡將細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，分組后再培養(yǎng)24 h；胰酶消化后分別收集各孔細胞，離心5 min后，收集1×105～5×105個細胞；加5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI混勻；室溫避光反應5～15 min；1 h內(nèi)上機檢測。

1.6 Western blot檢測p-ERK/ERK、cyclin D1、survivin及cleaved caspase-3蛋白表達細胞分組培養(yǎng)2 h后，收集細胞提取蛋白；采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)至等濃度后加入上樣緩沖液混合，離心后上樣；恒壓80 V電泳，30 min后改為恒壓120 V至電泳結(jié)束；將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉，加入相應一抗，在搖床上4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次后，加相應二抗室溫孵育2 h，洗膜后顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析，計算各條帶光密度(optical density，OD)值，以靶蛋白與內(nèi)參蛋白的OD值比值代表相對蛋白的表達量。

2 結(jié)果

2.1 U0126抑制乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB231的增殖根據(jù)各組OD值(Tab 1)及公式：抑制率/%=(1-藥物干預組OD值/對照組OD值)×100%，計算抑制率。結(jié)果顯示，U0126干預組MCF-7、MDA-MB231細胞在24 h的抑制率分別為45.12%、29.11%；48 h抑制率分別為49.57%、36.73%，與對照組比較，差異有顯著性(P<0.01)，說明U0126能有效抑制乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB231的增殖。從結(jié)果中我們也發(fā)現(xiàn)，U0126對MCF-7的抑制作用要強于MDA-MB231，兩種細胞48 h的抑制率要高于24 h，但差異無顯著性(P>0.05)。

Tab 1 The optical density(OD) measured at492 nm in different n=6)

**P<0.01vsMCF-7;##P<0.01vsMDA-MB231

2.2 U0126將MCF-7、MDA-MB231細胞周期阻斷在G0/G1期細胞周期結(jié)果顯示(Fig 1、Tab 2)，與MCF-7、MDA-MB231組細胞相比，U0126干預組G0/G1期細胞比例明顯增加，S及G2期細胞比例下降(P<0.05，P<0.01)，說明U0126可使細胞停滯于G0/G1期，抑制細胞分裂增殖。

Fig 1 Cell cycle assay in different groups

2.3 U0126增加MCF-7、MDA-MB231早期凋亡細胞如Fig 2所示，MCF-7、MDA-MB231組細胞凋亡率分別為(2.8±0.35)%、(2.6±0.38)%，U0126干預組細胞凋亡率分別為(14.5±2.12)%、(22.7±3.21)%，較未干預組凋亡率分別增加了約4倍和8倍(P<0.01)。

Tab 2 Cell cycle assay in different

*P<0.05,**P<0.01vsMCF-7;#P<0.05,##P<0.01vsMDA-MB231

2.4 U0126可抑制cyclin D1表達Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，U0126(5 μmol·L-1)處理人乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB231 2 h后，可阻斷ERK的磷酸化，降低cyclin D1的蛋白表達，與對照組相比，差異具有顯著性(P<0.01)。說明U0126通過抑制p-ERK表達，下調(diào)cyclin D1，將細胞周期阻斷在G0/G1期，抑制乳腺癌細胞的增殖。

2.5 U0126可抑制survivin上調(diào)cleaved caspase-3表達如Fig 4所示，U0126(5 μmol·L-1)處理人乳腺癌細胞2 h后，survivin表達明顯減少，分別為未處理組的40.1%、26.3%；而cleaved caspase-3的表達明顯增高，分別為未處理組的2.58倍、2.76倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討論

乳腺的各級導管及腺上皮均可發(fā)生異常增生，導致乳腺癌，腺上皮增生可發(fā)展為不典型增生，進一步演變?yōu)樵话⒃缙诮櫚┖徒櫺园偕掀ぜ毎漠惓Ｔ錾侨橄侔┌l(fā)生發(fā)展的基礎，而癌細胞的增殖受到許多信號通路調(diào)控[5]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一條十分重要的信號通路，細胞的生長、發(fā)育、分裂、死亡等許多生理過程都受其調(diào)控，而胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)是MAPK家族中眾多成員中最核心的環(huán)節(jié)。ERK可以調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和存活，是多種生長因子(EGF、NGF、PDGF等)的下游蛋白[6]。一方面，ERK能夠接受生長因子、絲裂原、環(huán)境刺激等信號；另一方面，ERK通過信號級聯(lián)反應，作用于AP-1、NF-κB等核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因表達，從而在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮中介和信號放大的作用。ERK的過度激活在許多人類的癌癥，如口腔癌、黑色素瘤、乳腺癌等中均有發(fā)現(xiàn)[7]。目前，國內(nèi)外已大量開展針對ERK途徑中各個環(huán)節(jié)的相關(guān)研究，希望能夠找到相關(guān)抑制物，用以切斷信號轉(zhuǎn)導途徑，從而達到治療疾病的目的[8]。

Fig 3 Protein levels of p-ERK and cyclin D1

**P<0.01vsMCF-7;##P<0.01vsMDA-MB231

Fig 4 Protein levels of survivin and cleaved

**P<0.01vsMCF-7;##P<0.01vsMDA-MB231

本實驗中，我們首先選用人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB231為研究對象，ERK抑制劑U0126處理乳腺癌細胞后，通過MTT法，觀察U0126對MCF-7、MDA-MB231增殖的影響。MCF-7和MDA-MB231都是乳腺癌細胞，但是二者侵襲能力不一樣，細胞形態(tài)差別大，有些基因表達也不同，如SP7基因在MCF-7細胞中不表達，但是在MDA-MB231中高表達。MCF-7為體外培養(yǎng)雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性乳腺癌細胞系，惡性程度較MDA-MB231低，MDA-MB231為ER陰性，增殖速度相對較快，且屬于高轉(zhuǎn)移性惡性乳腺癌細胞系。我們選擇兩種乳腺癌細胞系，主要觀察U0126對不同乳腺癌細胞是否均能發(fā)揮抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U0126可以明顯抑制乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB231的增殖。癌細胞的增殖主要有兩方面的因素，一方面是促進細胞進入增殖周期，分裂加速；另一方面是減少細胞凋亡[9]。所以我們接下來分別檢測了U0126對MCF-7、MDA-MB231細胞周期及細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，U0126可以將MCF-7、MDA-MB231的細胞周期阻斷在G0/G1期，同時增加早期凋亡細胞的比例。

正調(diào)控蛋白cyclin、細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)，以及負調(diào)控蛋白CDK抑制因子(CDK inhibitor，CKI)可以對細胞周期的每一個階段進行調(diào)控。cyclin與CDKs通過形成cyclin-CDKs復合物，對細胞周期進行共同控制，使細胞嚴格按照G1期-S期-G2期-M期的順序連續(xù)進行復制。cyclin D(D1、D2、D3)是細胞由靜止G0期進入G1期所必需的，一些生長因子可刺激cyclin D表達水平升高，并與CDK4或CDK6結(jié)合進入胞核，激活下游途徑，啟動細胞DNA復制，促使細胞通過G1/S調(diào)控點[10]。Cyclin D1在細胞增殖的G1期發(fā)揮作用，正向調(diào)控細胞周期，促進DNA的合成及細胞的增殖，從而促進腫瘤的發(fā)展[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，U0126可以將MCF-7、MDA-MB231的細胞周期阻斷在G0/G1期，所以接下來我們檢測了cyclin D1，發(fā)現(xiàn)U0126可以明顯減少cyclin D1的表達量，說明U0126通過調(diào)控cyclin D1將細胞周期阻斷在G0/G1期，進而抑制乳腺癌細胞的增殖。

細胞凋亡作為一種由基因控制的程序性死亡，可以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，這些基因在種屬之間的保守性非常高，如caspase家族、Bcl-2家族、抑癌基因p53、癌基因c-Myc等。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，是一種只表達于腫瘤和胚胎組織的蛋白，涉及腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移[12]。17q25染色體的BIRC5基因編碼survivin蛋白，其僅含有單一的抗凋亡活性必不可少的桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復序列(BIR)功能區(qū)、1個C末端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，通常以二聚體的形式存在[13]。在細胞增殖過程中，高表達survivin的細胞可越過G2/M，直接完成異常有絲分裂，造成細胞周期縮短，導致腫瘤增殖速度加快。同時p53、Fas等細胞凋亡因子也可被高表達的survivin抑制，導致細胞的凋亡減少，促進腫瘤的無限增殖[14]。也有研究表明，survivin具有誘導新生毛細血管形成的作用，從而為腫瘤的無限增殖創(chuàng)造了良好的營養(yǎng)環(huán)境[15]。Survivin抑制細胞凋亡的機制有以下兩種可能:① 對凋亡終末效應酶caspase-3和caspase-7的活性進行直接抑制，從而阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程; ② 通過survivin與周期蛋白激酶CDK4、CDK2之間的相互作用，阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導通路[16]。U0126可以增加MCF-7、MDA-MB231早期凋亡細胞的比例，通過檢測survivin、cleaved caspase-3的蛋白表達，我們發(fā)現(xiàn)U0126可以明顯抑制survivin表達，而增加cleaved caspase-3表達量，說明U0126通過調(diào)控survivin表達而增加細胞凋亡，從而抑制乳腺癌細胞的增殖。

綜上所述，本研究證實MCF-7、MDA-MB231細胞中ERK信號通路被異常激活，U0126通過阻斷ERK信號通路調(diào)控cyclin D1，將細胞周期阻斷在G0/G1期，抑制survivin蛋白表達，而增加cleaved caspase-3表達量，促進細胞凋亡，從而抑制乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB231的增殖。這一結(jié)果為使用信號通路阻斷劑治療乳腺癌提供了重要的實驗依據(jù)。