1-磷酸鞘氨醇及其信號通路在炎癥相關性疾病中的作用

卜妍紅，吳 虹，孫明慧，張 衡，戴學靜，王 言，占 翔

(安徽中醫藥大學藥學院，新安醫學教育部重點實驗室，中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

鞘脂及其代謝酶是體內的關鍵介質，鞘氨醇激酶(sphingosine kinases，SphKs)及其脂質產物1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)在信號傳導以及疾病，特別是在慢性炎癥疾病和自身免疫疾病的發生、發展中起重要作用[1]。S1P是一種具有多種生物活性的鞘脂類代謝產物，廣泛存在于血小板、紅細胞、中性粒細胞和淋巴液、血液等細胞和體液中。神經酰胺(ceramide，Cer)經神經酰胺合成酶脫羧化作用后，轉化成鞘氨醇(sphingosin，Sph)，不同細胞因子和生長因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可激活SphKs，然后SphKs催化Sph磷酸化生成S1P。S1P經S1P裂解酶(S1P lyase，SPL)和S1P磷酸酶(S1P-phosphatases，SPP)發生不可逆的降解，以維持機體內S1P的動態平衡。其中，“鞘磷脂變阻器”(Cer/S1P rheostat)是決定細胞的存亡和增殖的關鍵[2]，S1P促進細胞的存活和增殖，其前體Cer和Sph則抑制細胞存活、促進細胞凋亡。細胞內的Cer、Sph和由SphKs介導的酶促反應共同維持動態平衡，從而決定細胞的存活，維持細胞的生理功能。

S1P生成后，可在細胞內、外發揮作用。一方面，通過自分泌和旁分泌的方式作用于細胞表面受體，發揮其細胞外效應，包括細胞增殖和遷移、炎性細胞因子浸潤、血管生成、自身免疫等。另一方面，發揮細胞內第二信使功能，直接作用于細胞內靶點，調控Ca2+水平、基因轉錄、蛋白質修飾等。

1 S1P胞外作用方式

S1P的主要作用方式是胞外作用，即質膜上產生的S1P分泌到細胞外，與胞膜上S1P受體(S1P receptors，S1PRs)結合發揮作用。S1PRs是G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)家族成員，包括S1PR1～S1PR5五個亞型。S1PR1～S1PR5均與Gi/o偶聯，S1PR2、S1PR3與Gq偶聯，除S1PR1外，其余的S1PRs均與G12/13偶聯[3]，可以激活Ras/ERK1/2、PI3K/Akt等下游信號通路，發揮多種生物學效應，包括調節細胞增殖、遷移、凋亡以及炎癥因子和黏附因子生成。

1.1 Ras/Raf/MEK/ERK途徑細胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，ERK家族有5個亞族，為ERK1～ERK5，ERK1和ERK2是ERK家族中研究最徹底的。作為傳遞絲裂原信號的信號轉導蛋白，其正常情況下存在于胞質，受多種刺激因子如細胞因子、生長因子、癌基因、GPCRs的配體等激活，激活后轉移至細胞核，調節轉錄因子活性，介導不同的細胞效應。其中，最經典的為Ras/Raf/MEK/ERK激活途徑。

當S1P與S1PRs結合后，生長因子受體結合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2，Grb2)識別激活的受體并與之結合，同時Grb2的SH3結構域與鳥苷酸交換因子SOS的C端序列相結合，形成S1PRs-Grb2-SOS復合物。該復合物促進胞質蛋白SOS向膜聚集，并在Ras蛋白附近形成高濃度的SOS，SOS與Ras-GDP結合，并轉化為Ras-GTP，Ras構象改變，由失活態轉變為激活態，Ras活化。Raf在N端和C端結構域中有與Ras結合的重要區域，Ras作為上游激活蛋白，與c-Raf的兩個區域高度親和后，Raf被募集到質膜進行活化，激活Raf。Raf被激活后，其C端催化區能與MEK(MAPKK)結合，并磷酸化其催化區中2個絲氨酸，從而激活MEK。MEK作為一種雙重特異性激酶，催化ERK酪氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，從而高度選擇性地激活ERK[4-5]。

Ras/Raf/MEK/ERK不僅廣泛地調節細胞功能，還在疾病的發病機制及病理過程中發揮重要作用。S1PR1經MEK1/2-ERK1/2信號通路，調節人臍靜脈內皮細胞的遷移，血管內皮細胞遷移對于維持血管正常功能和結構穩定具有不可忽視的作用，從而發揮如抗動脈粥樣硬化、抗炎以及內皮保護功能等[6]。S1PR1和S1PR3通過ERK信號轉導，增加人骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)遷移，MSC介導的軟骨損傷修復在于增加基質合成、軟骨細胞增殖、調節免疫反應。軟骨損傷后，大量分泌多種炎性細胞因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)等，導致炎癥加重、軟骨基質降解和軟骨凋亡。但當ERK信號通路活化后，MSC遷移至損傷部位，減少炎性細胞的浸潤和炎性細胞因子的分泌[7]。此外，在動物實驗中，抑制c-Raf-1和c-Myc的表達，可明顯減弱類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)患者成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)對SCID鼠模型軟骨的侵蝕[8]，其中，c-Raf-1是ERK信號通路的上游分子，c-Myc是ERK信號通路下游轉錄因子。以上結果提示，ERK信號通路在介導RA發病過程中發揮重要作用，通過調節ERK通路能改善RA的病情發展。因此，為了探索生命活動最基本的生理機制和過程，尋找針對性的治療方法，我們深入研究信號轉導過程及其涉及到的上游蛋白和各種激酶的激活機制。

1.2 PI3K/Akt途徑PI3K/Akt信號通路是炎癥、腫瘤等發生發展過程中一條重要的信號通路。磷酯酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是由催化亞基p110和調節亞基p85所構成的異源二聚體，具有脂類激酶(磷脂酰肌醇激酶)和蛋白激酶(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)的雙重活性，能被多種因子，如血小板衍生因子、表皮生長因子等激活，發揮促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的正性調節作用。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白，多種生長因子、激素、抑癌基因PTEN和Ras均可調節Akt的活化[9]。

S1P與膜表面受體結合后，PI3K將收到來自GPCRs的信號，p85調節亞基即被募集到質膜附近，p110亞基通過與p85亞基結合，催化PIP2磷酸化以產生脂質第二信使PIP3，PTEN使PIP3去磷酸化，抑制PI3K的產生。PIP3和含有PH結構域的PKB結合，促使Akt從細胞質轉移至細胞膜，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase D1，PKD1)和哺乳動物雷帕霉素靶復合體2(mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2)的作用下，分別磷酸化Akt蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點(Thr308)和絲氨酸磷酸化位點(Ser473)，激活Akt[10]。活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶點蛋白，進而調控細胞的增殖、凋亡、分化、代謝等(Fig 1)。

內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在內皮細胞修復與炎癥血管新生中起重要作用。有研究顯示[11]，抑制Akt的活性和磷酸化可以減少S1P誘導的EPCs增殖，S1P增強EPCs的增殖主要通過S1PR3介導，減少H2O2誘導的EPCs凋亡主要通過S1PR1介導；S1PR1/S1PR3/PI3K/Akt信號通路在S1P刺激EPCs后，有助于血管新生和內皮化。因此，增加EPCs的數量和提高這些細胞的活性可能是血管炎癥疾病的一個治療靶點。眾所周知，EPCs能夠通過增殖、遷移修復受損血管，并最終分化為內皮細胞(endothelial cell，EC)。在EC中，S1PR2通過促進PI3K/Akt信號通路，增強TNF-α誘導的促炎因子和黏附因子，如VEGF、細胞間黏附因子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的表達來加重血管壁炎癥[12]。VEGF促進血管新生，新生血管不僅為滑膜增生提供氧氣和營養物質，另一方面，隨著炎性細胞和所產生的炎性介質的流入，也促進了滑膜炎癥的持續存在。而PTEN過度表達或者PI3K/Akt抑制劑可以使VEGF表達減少，因此，抑制其表達可改善RA的病理過程；上調黏附分子的水平有助于多形核細胞對炎性組織的募集、介導中性粒細胞的黏附性，以便于中性粒細胞通過血管內皮屏障并和上皮細胞相互作用，從而起到促動脈粥樣硬化的作用。

Fig 1 Extracellular function of S1P

Cer in lysosome and plasma membrane is decarboxylated and converted to Sph. Activated SphKs catalyzes the phosphorylation of Sph, leading to the production of S1P. S1P transports outside the cell and acts on GPCRs on cell surface. 1.Ras/Raf/MEK/ERK pathway: When S1P binds to S1PRs, Grb2 recognizes and binds to the activated receptors. Meanwhile, Grb2 binds to SOS to form the S1PRs-Grb2-SOS complex, which promotes SOS aggregation in Ras and mediates cell apoptosis, proliferation, migration and differentiation after Ras/Raf/MEK/ERK cascade activation. 2. PI3K/Akt pathway: After the binding of S1P to S1PRs, the p85 subunit is recruited and bound to the P110 subunit, which catalyzes the phosphorylation of PIP2 to produce PIP3. Under the action of PKD1 and mTORC2, PIP3 phosphorylates Thr308 and Ser473 on Akt protein respectively and activates Akt, which regulates cell growth, proliferation and metabolism.

2 S1P胞內作用方式

隨著S1P的發現，人們對S1PRs多種多樣的生物學功能進行了大量研究，但已有證據表明，S1P的某些下游生物學效應并不直接依賴于胞外受體，而是S1P行使類似第二信使的功能直接作用于胞內靶點，調節相關生物過程。目前較為明確的S1P胞內靶點是組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)和腫瘤壞死因子受體輔助因子2(TNF receptor-associated factor 2，TRAF2)。

2.1HDACHDAC是一類蛋白酶，在哺乳動物細胞中分為4類，其中，HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8組成的Ⅰ類HDAC，在所有組織細胞的細胞核中普遍表達。作為表觀遺傳調節因子，HDAC使核組蛋白和非組蛋白可逆地脫乙酰化，廣泛調節基因的表達。組蛋白乙酰化轉移酶(histone acetyl transferases，HATs)和HDAC之間存在的平衡，影響組蛋白的乙酰化和去乙酰化水平。當平衡發生改變時，疾病相關基因的失調將導致慢性炎癥和癌癥等疾病[13]。

S1P是HDAC內源性調節因子，作用類似于HDAC抑制劑，通過影響HDAC的活性調控基因表達。細胞核內的SphKs選擇性富集，產生的S1P通過特異性結合HDAC抑制其活性，進而保護組氨酸末端的賴氨酸不被去乙酰化。組蛋白乙酰化水平升高后，DNA與組蛋白八聚體解離，使各種轉錄因子能與DNA特異性結合，激活基因轉錄(Fig 2)。HDAC抑制劑具有調節炎癥基因表達、細胞增殖和DNA修復，對機體的不良反應小的特點，因此，被廣泛用于各種慢性炎癥疾病及惡性腫瘤的治療。RA的一大病理特征是FLS的異常增殖和炎性細胞浸潤，HDAC抑制劑有效下調了RASFs中促炎因子IL-6、IL-8 mRNA表達，來減輕滑膜細胞異常增殖和關節炎癥[14]。HDAC1在RA患者的滑膜組織中高度表達，因此，設計靶向HDAC1的HDAC抑制劑作用于TNF-α刺激的單核細胞和破骨細胞，減少了炎性細胞因子和趨化因子，如IL-1、MCP-1、巨噬細胞炎性蛋白1α的mRNA表達，減輕炎癥和骨質流失，從而達到治療RA的效果[15]。HDAC抑制劑不僅廣泛作用于不同類別的HDAC靶標，還在轉錄調節和蛋白質修飾中起重要作用，因此，HDAC抑制劑具有治療潛力。

2.2TRAF2TRAF是銜接蛋白家族，通過連接細胞表面受體和下游激酶級聯反應，導致轉錄因子激活，參與炎癥、細胞凋亡、細胞存活等多種反應。TRAF家族由TRAF1-TRAF7組成，它們共享1個由N端卷曲螺旋結構TRAF-N和TRAF-C組成的TRAF結構域，雖然不同TRAF蛋白的TRAF結構域高度相似，但TRAF-C結構域的差異決定了與特異性受體和下游效應蛋白的相互作用，從而介導細胞中不同的生理作用[16]。表達最廣泛的TRAF2作為銜接蛋白和調控因子，在幾乎所有分支通路中起作用，主要激活的NF-κB和JNK在許多生理病理過程中發揮重要作用，如免疫、炎癥反應、細胞增殖與凋亡、腫瘤的發生。

Fig 2 Intracellular function of S1P——HDAC pathway

HAT acetylates histones, dissociates DNA from histone octamers, and activates gene transcription by specific binding of transcription factors to DNA. HDAC deacetylates histones, allowing histones to bind tightly to DNA. Chromatin is densely curled and gene transcription is inhibited. SphKs catalyzes the production of S1P, which is similar to HDAC inhibitors. By specifically binding to HDAC, the activity of S1P is inhibited and the level of histone acetylation increases, which promotes gene transcription.

TRAF2不僅是S1P在胞內的直接作用靶點，也是TNF-α觸發NF-κB信號的關鍵元件。胞質中的SphK1結合于TRAF2的指環結構域(ring domain)，產生的S1P可以直接與TRAF2結合，并激活E3泛素連接酶活性。活化的TRAF2可以使受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein，RIP)多泛素化，之后募集并激活IκB激酶，這些啟動NF-κB通路的反應是由細胞內的S1P介導的，與細胞膜表面的GPCRs無關[17]。激活的NF-κB易位至細胞核，作用于靶基因特異性結合位點，并促進基因的表達(Fig 3)。有研究表明[18]，小膠質細胞(microglia，MG)作為中樞神經系統中的固有免疫細胞活化后，產生過量的促炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1β和其他促炎介質，參與神經元炎癥損傷。在MG中，SphK1通過TRAF2/NF-κB途徑，抑制IL-17的減少以及神經元凋亡。因此，阻斷TRAF2/NF-κB軸可能是控制神經在腦內的免疫反應的潛在治療目標。另有研究表明[19]，若經TRAF2激活下游NF-κB信號通路，活化的TRAF2分子參與介導PGE2-EPs-cAMP信號通路的異常，進一步降低細胞內cAMP水平，加重滑膜功能紊亂。滑膜組織在RA中起到重要的作用，滑膜細胞不僅增殖，還增加遷移和流動性，侵入并破壞軟骨，從而加重病情。此外，在IL-Iβ誘導的骨關節炎(osteoarthritis，OA)中，軟骨細胞活力下降、細胞凋亡率增加，IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表達水平明顯上升。與正常軟骨組織相比，OA患者軟骨組織中TRAF2水平明顯升高，TRAF2沉默恰好反轉IL-1β對軟骨細胞增殖、凋亡、炎癥反應的影響，從而減緩OA的發生、發展[20]。

Fig 3 Intracellular function of S1P——TRAF2/NF-κB pathway

SphK1 binds to TRAF2, allowing the S1P direct binding to TRAF2 and then multiubiquitizes RIP to initiate the NF-κB pathway. 1. Classic pathway: RIP recruits and activates IKK, which degrades IκB and releases NF-κB from trimers. NF-κB specifically binds to the κB site of the target gene to regulate the transcriptional activity of downstream genes. IKKβ plays a major role in this process. 2. Non-classical pathway: NIK activated by RIP activates IKKα selectively, which degrades P100 into p52. The dimer of p52 and Rel B enters the nucleus and activates the downstream gene transcription by activating NF-κB. This process depends on NIK and IKKα, not IKKβ and IKKγ.

3 S1P信號通路相關藥物研究進展

根據對S1P的研究，主要是從3個方向對S1P信號通路進行調控。S1P受體調節劑是通過對不同S1PRs亞型激動或抑制進行調控，如研究較多的S1P類似物芬戈莫德(fingolimod，FTY720)；SphKs抑制劑是影響S1P的合成和降解過程；S1P特異性抗體是直接靶向S1P的抗體，通過清除血液或其他部位的S1P分子來發揮作用。

3.1 S1P受體調節劑靶向S1P信號傳導的藥物大多數都針對于S1PRs，而不是配體或其他代謝途徑，是因為GPCRs是高度多樣化的細胞表面受體，介導幾乎所有細胞類型的基本過程；其次，盡管已發現S1P的細胞內靶標，但S1P的作用主要還是由S1PRs介導。FTY720正是通過S1PRs介導發揮作用，說明S1PRs是經臨床驗證的治療藥物靶標。

FTY720是首個口服用于治療多發性硬化癥(multiple sclerosis，MS)的新型免疫抑制劑。作為鞘氨醇類的前藥，并不直接抑制淋巴細胞的激活和增生，而是經SphK1磷酸化成活性代謝物p-FTY720，與特定的S1PRs結合(除了S1PR2)，通過影響趨化因子介導的淋巴細胞歸巢，減少外周血淋巴細胞數，并抑制淋巴細胞活性，發揮免疫抑制的作用[21]。正常情況下，S1PRs與S1P結合后很快失活，并內化到細胞質囊泡中，但會再循環到質膜以用于隨后的信號傳導。相反，與FTY-720結合后，S1PRs不會再循環到質膜，它被保留在囊泡中被溶酶體降解，最終導致細胞表面的功能活性受體S1PRs耗盡。現已證明[22]，FTY720可降低滑膜中IL-6和TNF-α的表達來緩解滑膜炎癥和炎癥細胞浸潤關節組織，最終起到治療RA的作用。此外，由于其親脂性，FTY720穿過血腦屏障，作用于血腦屏障的內皮細胞時，會減少炎性細胞因子誘導的細胞死亡；FTY720處理明顯下調脂多糖刺激的MG釋放炎癥介質，緩解神經炎癥[23]。FTY720的臨床成功，極大地鼓勵了研究人員以S1P為切入點展開研究，尤其是S1P代謝中涉及的重要蛋白質，如S1PRs、SphKs和SPL。

3.2 SphKs抑制劑由于調節S1P代謝途徑相對簡單明確，該代謝途徑中主要的酶SphKs成了研究的目標。盡管此方法靶向性不高，無法針對特定的受體，但能夠調節整體S1P水平，當治療的靶受體不明確時或未知時，調節總S1P水平成為了可行的方法。

SphKs抑制劑的作用機制主要是抑制SphKs的活性，減少Cer/Sph向S1P的轉化，不僅能降低促細胞存活與增殖的S1P合成，同時還能增加促凋亡與周期阻滯的Cer/Sph生成，SphKs是維持這種平衡的重要調節劑。在多種慢性炎癥疾病及癌癥中SphK1過表達，參與細胞的增殖遷移以及血管生成，新生血管不僅為細胞增殖提供營養物質，另一方面, 隨著炎性細胞和所產生的炎性介質流入,也促進了炎癥的持續存在。在許多類型的癌癥和炎癥性疾病中，SphK1過度表達，因此，SphK1是治療炎癥發展的主要目標。ABC294640作為特異性SphK2抑制劑增加了Cer的積累，降低存活的S1P含量，抑制了小鼠肝臟炎癥并激活細胞凋亡機制，從而抑制腫瘤的生長。盡管SphKs抑制劑對于各種癌癥模型都有效，但在關節炎中的作用存在著爭議。大鼠實驗使用siRNA降低SphK2表達，不能明顯改善關節炎的癥狀，ABC294640卻引起關節炎癥狀加重[24]。因此，與阻斷SphK1的明顯抗炎作用相比，SphK2雖可作為癌癥治療或增強免疫反應的候選者，但在自身免疫或自身炎癥疾病中應避免其阻斷。針對鞘氨醇激酶途徑的治療需要特異性地靶向鞘氨醇激酶，以更好地利用其治療潛力。

4 展望

自從發現S1P作為GPCRs家族的高親和力配體后，鞘脂生物學領域已成為一大研究熱點。S1P參與多種重要的生物過程，其功能不僅存在于它的化學結構中，還通過不同的信號通路引起多樣的生物學變化，包括生理病理過程。這些累積的發現證明，S1P是調節免疫應答、炎癥過程、腫瘤以及心血管系統的關鍵信號分子。目前，對S1P介導生物功能的研究越來越多，但缺乏對作用機制和各個生物功能關聯性的研究。對S1P多樣的受體亞型、復雜的下游信號和信號通路的重疊表達的深入探索，正契合了炎癥免疫反應軟調節這一概念，多種靶細胞的關鍵分子活性的平衡調控，是研究炎癥相關性疾病治療藥物的重要方向[25]。靶向配體和受體功能的藥物已經開發并處于臨床前和臨床發展的不同階段，這一領域的明顯進步是由遺傳學和藥理學方法所促進的，各種復雜的信號系統是潛在的有趣的治療靶點，可能在未來帶來更大的發現。