甘藍型油菜角果長度性狀的全基因組關聯分析

孫程明 陳 松 彭 琦 張 維 易 斌 張潔夫,* 傅廷棟

1 江蘇省農業科學院經濟作物研究所 / 農業部長江下游棉花與油菜重點實驗室 / 江蘇省現代作物生產協同創新中心,江蘇南京 210014；2 華中農業大學植物科學技術學院 / 作物遺傳改良國家重點實驗室,湖北武漢 430070

油菜是我國重要的油料作物,種植面積約690萬公頃,產油量占國產植物油總量的55%以上,是我國最大的食用植物油來源[1]。作為食用油消費大國,我國食用油自給率僅35%左右,因此,提高產量成為油菜育種最迫切的目標。角果長度是油菜重要的產量相關性狀,解析其遺傳基礎對提高油菜產量具有重要意義。

角果是油菜重要的光合產物貯存器官,適度增加角果長度,可增加角果庫容量,有利于灌漿物質向籽粒中運輸,每角粒數和籽粒大小也隨之提高[2]。此外,角果還是油菜成熟后期重要的光合器官,在角果完全伸展后,角果皮面積占全株光合面積的60.6%[3]；對角果遮光處理導致油菜的千粒重降低54.7%、籽粒產量降低62.1%、含油量降低44.2%[3]。冷鎖虎等[2]研究表明,角果長度每增加1 cm,群體中角果皮面積占總光合面積的比例增加2.64%。因此適度增加角果長度有利于擴大角果庫容量,增加全株光合面積,從而提高油菜的籽粒產量。

油菜角果長度是受多基因調控的數量性狀,眾多研究者采用遺傳差異較大的雙親構建連鎖群體,進行角果長度的QTL 定位。Udall 等[4]定位的角果長度QTL 分布在A09、C02 和C08 連鎖群,其中A09連鎖群的QTLln9.5貢獻率為25.3%[4]；Yang 等[5]定位到的QTL 分布在A01、A02、A06、A07、A09、C02、C03 和C04 連鎖群,其中A09 連鎖群的QTLqSLA9.3能解釋65.6%的表型變異；漆麗萍[6]在A01、A07、A09 和A10 連鎖群檢測到11 個QTL,其中貢獻率最大的2 個QTL 均位于A09,在3 個環境中分別解釋38.3%～60.0%和 11.2%～16.5%的表型變異；Wang 等[7]在A05、A06、C01、C05 和C06 檢測到11 個QTL,解釋3.4%～14.36%的表型變異；Fu 等[8]在A01、A05、A09 和C08 連鎖群上檢測到20 個角果長度QTL,效應最大的2 個QTL均位于A09；Yang等[9]在A05、A09、C02、C08 和C09 檢測到7 個角果長度QTL,位于C09 的主效位點解釋26.51%的表型變異。

近年來,隨著高密度SNP 基因分型芯片和全基因組測序等技術的發展,全基因組關聯分析(genome-wide association study,GWAS)已廣泛應用于玉米[10-11]、水稻[12-13]、油菜[14-15]等作物復雜性狀的遺傳結構解析。本研究利用60K SNP 芯片對群體進行基因型分析,并對角果長度進行全基因組關聯分析,旨在挖掘顯著的SNP 位點,分析其候選基因,為油菜角果長度的遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于關聯分析的496 份甘藍型油菜包括地方品種、育成品種及高世代育種材料。其中國內資源444份,主要來自湖北、重慶、江蘇、湖南、四川、陜西等油菜主產省市；國外資源52 份,主要來自德國、瑞典、朝鮮、加拿大等國家(附表1)。所有材料均由華中農業大學國家油菜工程技術研究中心提供。

1.2 田間試驗與表型調查

2013年、2014年于江蘇南京(13NJ 和14NJ),2015年、2016年于江蘇泰州(15TZ 和16TZ),采用完全隨機區組設計種植自然群體,在南京設置3 次重復,在泰州設置2 個重復。單個材料每重復種2行,每行15 株,行寬1.5 m,行距40 cm,行長1.5 m。每年10月上旬大田直播,田間管理按當地常規方式進行。在油菜成熟期,取每小區8 株長勢一致的植株,選主花序中部10 個角果測量角果長度。利用R 軟件對各環境的角果長度表型進行統計分析和相關性分析,并計算廣義遺傳力和最佳線性無偏預測值(best linear unbiased prediction,BLUP)[16-17]。

1.3 基因型檢測與分析

利用Illumina 60K SNP 芯片分析基因型。在Genome Studio 軟件中,剔除Call Freq ＜ 0.75,Minor Freq ＜ 0.05,AA,BB frequencies ＜ 0.03 及GenTrain Scores ＜ 0.50 的SNP,基因型雜合的SNP 按缺失值處理。將過濾后的33,218 個SNP 序列比對至油菜Darmor-bzh基因組,E-value 閾值設為10-12,保留19,167 個單拷貝、位置清楚的SNP 標記用于后續分析。

1.4 全基因組關聯分析

用Structure 2.3.3 計算群體結構Q 矩陣[18],用SPAGeDi 計算材料間的親緣關系K 矩陣[19]。將基因型、表型、Q 矩陣和K 矩陣導入Tassel 4.0 后,以Q矩陣和Q+K 矩陣作協變量,分別進行基于一般線性模型(General Linear Model,GLM)和混合線性模型(Mixed Linear Model,MLM)的全基因組關聯分析[20]。關聯分析的顯著性閾值(Bonferroni threshold)定為1/總標記數,即-lg(P)= 4.28。當1 Mb 區間內存在多個顯著SNP 時,如果兩兩間的r2≥ 0.1,則將這些SNP 歸為一個關聯位點,以最小P值的SNP作為代表。用R 軟件包qqman 繪制曼哈頓圖和QQ(Quantile-Quantile)圖[21]。用R 軟件中逐步回歸分析的lm 功能分析關聯位點解釋的總表型變異。首先,挑選出關聯區間的lead SNP,將其中一種等位基因型標記成1,另外一種標記成-1,雜合和缺失位點標記成0；利用“stepAIC”函數,通過選擇最小的AIC(Akaike information criterion)信息統計量,逐步增加或剔除lead SNP,最終確定最適宜的模型,模型的R2即為總表型變異。

1.5 已報道QTL 的信息整理

目前有2 篇角果長度的關聯分析研究[22-23],2 個群體分別包含300 個和157 個株系,整理其顯著位點的信息并與本研究的結果比較。角果長度的連鎖分析報道很多,但多數研究的標記為SSR 和AFLP等傳統標記,數目少且無法準確確定其物理位置。漆麗萍[6]和Yang 等[9]分別用SNP 芯片對DH 群體進行基因型分析,本研究將其角果長度 QTL 兩側的SNP 標記比對至油菜Darmor-bzh參考基因組以獲得QTL 的物理區間。此外,Fu 等[8]利用混池測序將一個角果長度主效QTL 定位至油菜A09 染色體27.21～ 28.26 Mb 區段。

1.6 候選基因挖掘

以r2= 0.1 作為衰減閾值,用Tassel 計算顯著關聯位點的LD 衰減距離作為其置信區間。提取所有顯著位點置信區間內的基因CDS 序列,與擬南芥的基因CDS 進行BLAST 比對,E-value 閾值設為10-10,以相似度最高的擬南芥基因信息來注釋油菜基因。

2 結果與分析

2.1 表型統計分析

496 份油菜資源的角果長度在4 個環境中具有廣泛的變異,單個環境的角果長度極差范圍是5.93～ 12.52 cm。單個環境表型平均值范圍是(5.40±1.01)～(6.39±1.25)cm,變異系數范圍是0.13～ 0.20(表1和圖1)。由表2可知,4 個環境的角果長度存在極顯著相關(P≤ 0.001),表明本研究考察的表型數據具有較高的可靠性和重復性。根據R 軟件包lem4 的計算,角果長度在4 個環境的廣義遺傳力為86.0%。

表1 關聯群體角果長度性狀的統計分析 Table1 Statistical analysis of silique length of the association panel

圖1 關聯群體在4 個環境的角果長度分布 Fig.1 Distribution of silique length of the association panel in four environments

表2 4 個環境的角果長度相關系數 Table2 Correlation coefficients of silique length among four environments

2.2 角果長度全基因組關聯分析

利用MLM 模型,當閾值為-lg(P)= 4.28 時,檢測到15 個顯著SNP。合并存在連鎖不平衡的SNP(r2≥ 0.1),得到7 個顯著位點,分布在A07、A09、C02、C04 和C09 染色體(表3和圖2)。效應最大的位點Bn-A09-p29991443位于A09染色體[-lg(P)= 13.59],對表型變異的貢獻率為13.89%；攜帶其等位基因型A 的材料(48 份)角果長度均值為6.62 cm,比攜帶基因型T 的材料(389 份)角果長度均值增加0.89 cm。商品種如華油6 號、華油12 號、中雙5 號、中雙7 號、中雙11 號、寧油6 號、湘油13 號等,地方品種包括南川長角、湖北白花油菜等均攜帶該位點的優異等位基因型(附表2)。其余位點的-lg(P)值范圍是4.29～ 5.80,可解釋3.21%～5.10%的表型變異。利用一般線性模型計算,7 個位點聯合解釋25.01%的表型變異。與單環境的關聯結果比較,5 個BLUP 位點在單環境中被重復檢測到,3 個位點在2 個環境中得到驗證,Bn-A09-p29991443 位點在3 個環境中被重復檢測到。

通過GLM 模型共檢測到136 個顯著SNP,合并存在連鎖不平衡的SNP 后得到25 個顯著位點,分布在A02、A03、A06、A07、A09、A10、C02、C04、C07、C08 和C09 染色體(表4和圖2)。效應最大的位點和 MLM 相同,在 GLM 模型中 Bn-A09- p29991443 的-lg(P)= 16.27,對表型變異的貢獻率為12.86%。其余的位點-lg(P)值范圍是4.31～9.38,可解釋2.91%～7.76%的表型變異。利用一般線性模型計算,25 個位點聯合解釋41.77%的表型變異。與單環境的關聯結果比較,23 個BLUP 位點在單環境中被重復檢測到,其中8、6 和5 個位點分別在2、3和4 個環境中得到驗證。比較2 個關聯模型的結果,5 個MLM 位點與GLM 重疊,合并重疊的位點共得到27 個位點。利用一般線性模型計算,27 個位點聯合解釋44.04%的表型變異。

圖2 油菜角果長度全基因組關聯分析(BLUP)Fig.2 Genome-wide association study of rapeseed silique length(BLUP)

表3 MLM 角果長度顯著關聯位點(BLUP)Table3 Significant GWAS loci of silique length in MLM(BLUP)

表4 GLM 角果長度顯著關聯位點(BLUP)Table4 Significant GWAS loci of silique length in GLM(BLUP)

2.3 與前人報道QTL 的比較

綜合MLM 和GLM 的結果,與已報道的角果長度QTL 結果比較,本研究發現的7 個位點與前人研究結果一致(表3和表4)。周慶紅等[22]、漆麗萍[6]、Fu 等[8]、Dong 等[23]通過不同的定位策略檢測到效應最大的位點均落在A09 染色體27.26～28.61 Mb區段。本研究中效應最大的位點Bn-A09-p29991443也同樣落在該區間。位于 A07 的位點 Bn-A07- p18319586 物理位置是20.22 Mb,與Dong 等[23]檢測到的角果長度顯著位點(范圍為19.76～20.57 Mb)重疊,緊鄰漆麗萍[6]檢測到的QTLqSL.A7.2(范圍為21.04～22.52 Mb)。位于C08 的位點Bn-scaff_16361_ 1-p241830 物理位置是27.75 Mb,與Yang 等[9]檢測到的QTLcqSL.C08a(范圍為25.92～27.79 Mb)重疊。此外,還有4 個位點與前人檢測的QTL 重疊或緊鄰。這些結果證實了本研究結果的可靠性。

此外,綜合MLM 和GLM 的結果,本研究共檢測到20 個新位點。多個位點效應較高,如位于A07的Bn-A07-p8572785 表型貢獻率為9.38%,位于C04的Bn-scaff_20817_1-p60579 表型貢獻率為7.98%。多個位點在多環境中被檢測到,可信度高,例如位于C04 染色體的位點Bn-scaff_27914_1-p9919 和Bn- scaff_20817_1-p60579 及位于C07 染色體的位點Bn- scaff_16069_1-p3731985,這3 個位點在4 個環境中均被檢測到。這些位點值得進一步驗證和研究。

2.4 候選基因挖掘

基于中雙11 號基因組注釋信息,在Bn-A09- p29991443 位點下游153 kb 和184 kb 處分別找到油菜角果長度已知基因ARF18和BnaA9.CYP78A9(表5)。ARF18編碼一個生長素響應因子,通過生長素信號途徑調節角果皮的細胞生長[24]。BnaA9.CYP78A9編碼一個細胞色素P450 單加氧酶,通過調節細胞的伸長影響角果長度[25]。基于Darmor-bzh基因組注釋信息,在Bn-A09-p3051349 位點上游252 kb 處找到一個候選基因BnaA09g05500,該基因的擬南芥同源基因FUL編碼一個MADS-box 轉錄因子,該基因突變導致植株角果無法伸長,果實不能正常開裂[26]。在Bn-scaff_ 20817_1-p60579 位點上游293 kb 處找到一個候選基因BnaC04g50960,該基因的擬南芥同源基因EOD3編碼一個細胞色素P450 單加氧酶,其功能缺失突變體角果長度縮短、種子變小[27]。在Bn-scaff_16069_1-p1668600位點下游490 kb 處找到一個候選基因BnaC07g36530,該基因在擬南芥中的同源基因DOF4.4屬于Dof 轉錄因子家族,RNAi 株系角果增長、產量增多[28]。此外,本研究還找到別的候選基因,如擬南芥已知基因GID1b和ga20ox1在油菜中的同源拷貝[29-30]。

表5 角果長度關聯位點候選基因信息 Table5 Information of candidate genes of silique length GWAS loci

3 討論

角果長度是油菜重要的農藝性狀,適度增加角果長度有利于擴大角果庫容量,增加植株光合面積,從而提高油菜的籽粒產量。因此,眾多研究者圍繞角果長度開展了一系列的定位工作,在油菜19 條染色體上均檢測到 QTL,對表型變異的貢獻率為3.4%～65.5%[4-9,22,23]。本研究對496 份油菜資源的角果長度進行4 個環境的考察,通過全基因組關聯分析挖掘到27 個顯著位點,分布在A02、A03、A06、A07、A09、A10、C02、C04、C07、C08 和C09 共11 條染色體,對表型變異的貢獻率為 2.91%～ 13.89%。多個研究者在A09 染色體27.26～28.61 Mb區段檢測到主效QTL,最高可解釋超過60%的表型 變異[5,6,8,22-23]。本研究中效應最大的位點 Bn-A09- p29991443 同樣落在該區間。此外,本研究還檢測到另外6 個與前人結果共定位的位點及20 個新位點,所有位點聯合解釋44.04%的表型變異。可將攜帶不同有利等位基因的材料雜交,利用與上述QTL 緊密連鎖的分子標記進行輔助選擇,聚合更多有利等位基因,培育角果長度理想的油菜新品種。

目前油菜中已克隆的角果長度基因較少,Liu等[24]和Shi 等[25]分別報道在A09 染色體克隆了角果長度基因ARF18和BnaA9.CYP78A9。2 個基因均落在本研究最顯著的位點Bn-A09-p29991443 所在區段,相距28.1 kb,處于緊密連鎖狀態。可能由于2個基因效應疊加,致使該區間的顯著性很高。此外,在對應的 C08 同源區段檢測到微弱的關聯信號(GLM,-lg(P)= 3.72),表明ARF18和BnaA9.CYP78A9位于C08 的同源拷貝,對角果長度的表型貢獻很小,與Liu 等[24]和Shi 等[25]的研究結果一致。Bn-A07-p8572785 是用MLM 和GLM 檢測到顯著性較高的位點,但在附近未找到角果長度已知基因。分析其附近基因的注釋信息,找到一個候選基因BnaA07g10150,該基因位于Bn-A07-p8572785 上游339 kb 處,其擬南芥同源基因PIN7編碼一個生長素運輸基因。生長素調節細胞的伸長生長,ARF18通過生長素途徑調節角果長度,因此BnaA07g10150的功能值得進一步研究。Bn-scaff_20817_1-p60579 是GLM 模型中顯著性較高的位點,根據基因注釋信息在該位點附近發現重要候選基因BnaC04g50960,其擬南芥同源基因EOD3同時調控角果長度和籽粒大小[27],后續研究可以通過轉基因或CRISPR 敲除驗證該基因的功能。

4 結論

用MLM 檢測到7 個位點,聯合解釋25.01%的表型變異；用GLM 檢測到25 個位點,聯合解釋41.77%的表型變異。合并共同的位點后得到27 個位點,其中7 個位點與前人QTL 共定位,其余20 個是新位點。效應最大的位點Bn-A09-p29991443 位于A09 染色體,在其附近檢測到油菜已克隆的角果長度基因ARF18和BnaA9.CYP78A9。此外,在其他多個位點附近發現擬南芥已知角果長度基因GID1b、FUL、EOD3、DOF4.4和GA20ox1的同源拷貝。

附表請見網絡版：1)本刊網站http：//zwxb.chinacrops.org/；2)中國知網http：//www.cnki.net/；3)萬方數 據 http：//c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb.aspx。