2個抗蟲棉的外源Bt基因分子鑒定及其染色體定位

周向陽 趙 亮 狄佳春 陳旭升,*

1 南京農業大學農學院,江蘇南京 210095；2 江蘇省農業科學院經濟作物研究所,江蘇南京 210014

國外轉Bt基因抗蟲棉的研究較早。1981年,Schnepfh等[1]首次從菌株HD-1 中克隆出蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白基因,并證明其抗蟲能力。1987年美國Agrocetus公司對Bt基因有關的DNA 序列片段進行了必要的修飾,然后利用農桿菌轉化法將其導入并整合到棉株的基因組中,使棉株成功地表達出抗蟲性狀,但其抗蟲能力不高,主要因為Bt基因來源于原核生物,序列富含A、T 堿基,在棉花植株中不易表達[2]。1989年,Monsanto 公司對單價Bt基因進行改造,即在不改變殺蟲晶體蛋白氨基酸序列的情況下,采用人工合成和點突變的方法,對Bt基因的特定位點進行改造,把序列中的A、T 堿基換成G、C 堿基,選取了適于棉花的啟動子,并在Bt基因所在位置的上游增加了增強子,然后把改造的Bt基因導入棉株。結果發現,與Bt基因未改造之前相比,殺蟲晶體蛋白在棉花植株中的表達量由原來的0.001%提高到0.05%～0.10%,抗蟲能力達70%以上[3]。1995年,美國農業部(USDA)首次通過了轉Bt基因棉的種植申請,并開始在美國國內大面積推廣生產轉Bt基因棉。1996年,Monsanto 公司與岱字棉公司首次合作,開展轉Bt基因抗蟲棉的選育和商業化工作,保鈴棉33B 是其代表性品種[4-5]。

我國對轉基因抗蟲棉的研究較晚,但進展迅速。1991年,謝道昕等[6]首次報道將Bt基因利用花粉管通道法導入本土棉花品種之中,獲得具有外源Bt基因的轉基因棉花植株,但抗蟲性能較差。1992年,郭三堆等[7]首先設計并人工合成了具有高效殺蟲活性的GFM Cry1A殺蟲晶體蛋白結構基因,并于1994年導入棉花植株,經過鑒定確認外源Bt基因已整合到棉花基因組中。在此基礎上與育種單位合作,成功選育出GK1、GK12、GK19、GKZ1 和晉棉26 等中國轉基因抗蟲棉品種,使中國成為繼美國之后的第二個能自主研發利用轉Bt基因抗蟲棉的國家[8]。

本研究以中國和美國的2 個主要抗蟲棉品種GK19 與33B 為試驗材料,通過PCR 檢測技術對中美Bt基因進行分子鑒定,進一步通過SSR 分子標記技術對Bt基因進行染色體定位,旨在從外源基因轉化事件的視角探究中美轉基因抗蟲棉差異的分子基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取中國抗蟲棉GK19、美國抗蟲棉33B,以及非轉基因海島棉“勝利1 號”、陸地棉“泗棉3 號”為試驗材料。在江蘇省農科院南京試驗田種植雜交F1代(GK19×勝利1號、33B×勝利1 號),開花期做自交、吐絮期收自交鈴,而后室內軋花獲得的種子即為F2代分離群體。將以上2 個海陸雜交F2代分離群體作為Bt基因的定位群體,其中[GK19×勝利1 號] F2代群體的個體數為184 粒種子,[33B×勝利1 號] F2代群體的個體數為185 粒種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子DNA 的提取 取親本以及雜交F1、F2的種子,每粒種子即為1 個個體。剝種殼得種仁,采用匡猛等[9]的方法提取單粒種子DNA。

1.2.2Bt基因來源的分子檢測 中美Bt基因PCR 擴增檢測的特異性引物序列來自王奕海等[10]的報道,中國Bt基因的擴增片段大小為456 bp,美國Bt基因的擴增片段大小為310 bp。特征引物序列為：F-1：5′-CATCTTCACTC GGTAACATCG-3′(456 bp)；F-2：5′-AGGGAACCTTCATC GTGG-3′(310 bp)；R：5′-ATACGTGCCAAGTGCCAACC-3′。

利用檢測Bt基因的特異性引物分別對抗蟲棉GK19、33B、清水、非抗蟲棉對照“泗棉3 號”進行PCR 擴增。PCR擴增產物在恒壓90V 條件下,經1%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統中觀察目的基因片段。

1.2.3 多態性標記篩選 SSR 引物系列來自Cotton Marker Database(網址http：//www.cottonmarker.org/)。從F2代分離群體,選取含Bt基因的個體10 個,不含Bt基因的個體10 個,“有”、“無”個體特征條帶清晰明顯。然后用scandrop250 超微量核酸蛋白測定儀測定選取個體的DNA濃度,統一稀釋成40 ng μL-1后,吸取等體積的DNA 溶液,構建近等基因混池。

利用本實驗室自主篩選獲得的234 對核心引物(它們相對均勻地分布于棉花26 對染色體上,每對染色體上平均分布9 對核心引物)[11],對雙親以及近等基因混池進行PCR 擴增,篩選多態性SSR 引物。

1.2.4Bt基因的染色體定位 用篩選獲得的多態性引物對F2群體的各個體DNA 進行PCR 擴增；而后經非變性PAGE 凝膠電泳,通過銀染檢測[12],得F2代各個體的標記基因型。在燈箱上觀察多態性條帶,統計F2代各個體的標記基因型,將與母本帶型相同的個體基因型記為“1”；與父本帶型相同的個體基因型記為“2”；共顯性雜合帶型記為“3”；缺失或無法辨別的帶型記為“0”。進行卡方適應性檢測,并驗證標記分離比例是否符合3∶1 的孟德爾遺傳規律。再利用JoinMap 4.0 軟件進行分子標記的連鎖分析,以鎖定目的引物與染色體；然后合成目的染色體上的SSR 引物進行圖譜加密,實現Bt基因的染色體定位。

2 結果與分析

2.1 轉Bt 抗蟲基因的PCR 檢測結果

利用檢測中美Bt基因的特異性引物,分別對抗蟲棉親本GK19 和33B 進行PCR 擴增,并以清水、非抗蟲棉品種“泗棉3 號”作為對照。通過PCR 擴增,依據擴增條帶大小進行分子鑒定。由圖1可以看出,抗蟲棉品種GK19的PCR 擴增條帶,符合中國Bt抗蟲基因設計引物的特征片段長度456 bp(泳道1),顯示GK19 為中國轉Bt基因抗蟲棉。而抗蟲棉33B 的PCR 擴增條帶,則擬合美國Bt抗蟲基因設計引物的特征片段長度310 bp(泳道2),顯示33B 為美國轉Bt基因抗蟲棉。清水(泳道3)與對照品種“泗棉3 號”(泳道4)則無特征擴增條帶。

2.2 Bt 基因在海陸雜交F2 代群體的分離規律

父本GK19 全部個體均含有中國Bt基因,母本“勝利1 號”全部個體均不含Bt基因。F1代全部個體均有中國Bt基因,F2代分離群體中含Bt基因和不含Bt基因的個體數目擬合3∶1 的分離比例(圖2和表1)。結果表明,該Bt基因為單位點插入,符合由一對顯性基因控制的孟德爾分離規律。

圖1 Bt 基因類型鑒定 Fig.1 Identification of exogenous Bt genes

圖2 中國產Bt 基因的PCR 擴增 Fig.2 PCR amplification of Bt gene from China

表1 GK19 和勝利1 號雜交后代Bt 基因的分離情況 Table1 Bt gene separation in hybrid offspring of GK19 crossing V-1

父本33B 及其F1代全部個體均含有美國Bt基因,母本“勝利1 號”全部個體均不含美國Bt基因。F2代分離群體中“有”與“沒有”Bt基因的個體數目擬合3∶1 的分離比例(圖3和表2)。表明該Bt基因也是單位點插入,符合由1 對顯性基因控制的孟德爾分離規律。

2.3 中美抗蟲棉Bt 基因染色體定位

2.3.1 GK19 中Bt基因的連鎖遺傳圖譜 對海陸雜交組合“GK19×勝利1 號”的親本及F2近等基因池進行差異性篩選,共得到22 對多態性引物。以這22 對多態性引物檢測F2代作圖群體每個單株的標記基因型。通過連鎖軟件分析,發現SSR標記 NAU2579 與Bt抗蟲基因連鎖,且為共顯性標記,兩者的初始遺傳距離為3.3 cM。由于標記NAU2579 位于第20 染色體,據此初步推斷該Bt基因位于第20 染色體。查閱棉花最新遺傳圖譜,合成位于該SSR標記上下遺傳距離50 cM 區間的83 對引物,通過對雙親篩選得到20 對多態性引物。用這些引物檢測F2代群體每個 單株的標記基因型,然后通過JoinMap 4.0 軟件進行遺傳連鎖分析。結果表明,共有 NAU2579、NAU2698、NAU2888、NAU3531、NAU3813、NAU3907、NAU5013、NAU5307、NAU6219、BNL119、BNL1253、BNL2570、BNL3646、dPL0108、Gh564、cgr6022 這16 對標記與Bt基因連鎖。位于Bt基因兩側的分子標記分別為NAU3907和NAU2579,遺傳距離分別為2.4 cM 和1.5 cM。由此將抗蟲棉品種GK19 所含的中國Bt基因定位在棉花第20 染色體上(圖4)。

圖3 美國Bt 基因的PCR 擴增 Fig.3 PCR amplification of Bt gene from USA

表2 33B×勝利1 號雜交后代Bt 基因的分離情況 Table2 Bt gene separation in hybrid offspring of 33B crossing V-1

圖4 抗蟲棉GK19 的外源Bt 基因連鎖遺傳圖譜 Fig.4 Exogenous Bt gene linkage map of insect-resistant cotton GK19

2.3.2 33B 中的Bt基因的連鎖遺傳圖譜 對海陸雜交組合“33B×勝利1 號”的親本及其F2近等基因池進行篩選,共得到37 對多態性引物。以這37 對多態性引物檢測F2代作圖群體每個單株的標記基因型,通過連鎖軟件分析發現,多態性標記NAU2912 和Bt抗蟲基因連鎖,且為共顯性標記,兩者的初始遺傳距離約為29.5 cM。由于標記NAU2912 位于第26 染色體,由此初步推斷該Bt基因位于第26 染色體。查閱最新棉花遺傳圖譜,合成位于該標記上下遺傳距離50 cM 區間的111 對引物,通過對雙親及F1代和近等基因池篩選得到23 對多態性引物。用這些引物檢測F2代群體每個單株的標記基因型,然后通過JoinMap 4.0 軟件進行遺傳連鎖分析。結果表明,共有20 對標記與Bt基因連鎖,它們分別是標記 NAU460、NAU2912、NAU3236、NAU3293、NAU3920、NAU4089、NAU4912、HAU1292、HAU2027、BNL3482、BNL3537、cgr5787、cgr5793、cgr6471、cgr6702、CIR085、dPL0380、dPL0796、dc40260、Gh568。位于Bt基因兩側的分子標記分別為NAU460 和dc40260,遺傳距離分別為3.6 cM 和2.0 cM(圖5)。由此,將抗蟲棉種質系33B 所含的美國Bt基因定位在棉花第26 染色體上。

圖5 抗蟲親本33B 的外源Bt 基因連鎖遺傳圖譜 Fig.5 Exogenous Bt gene linkage map of insect-resistant cotton 33B

3 討論

3.1 外源基因導入與遺傳轉化事件

外源基因導入棉花會產生不同的遺傳轉化事件。燕樹鋒等[13]分析轉基因抗草甘膦棉花的遺傳情況,檢測26 個抗草甘膦棉花轉化事件,只有20 個轉化事件分離符合3∶1的分離規律,其他6 個轉化事件出現了偏分離,顯示轉基因植株中外源基因的整合和遺傳機制相當復雜,并非完全遵從經典的孟德爾遺傳規律。不同轉化方法導入外源基因,其獲得遺傳轉化事件的拷貝數也不盡相同[14]。

轉基因作物的育種研發涉及多個環節,最關鍵的技術環節是如何把外源基因成功導入受體材料,最終篩選出結構完整、表達良好的轉基因品系,從而形成具有商業推廣價值的“轉化事件”(Transgenic event)[15]。目前的生物技術仍無法實現外源基因的定點整合,外源基因在受體基因組中的插入位點具有一定的隨機性,插入受體的染色體位置不同,其側翼序列也將表現不同；因此將產生不同的轉化事件。本研究顯示,外源Bt抗蟲基因導入陸地棉,既可以獲得插入棉花第20 染色體轉化事件,育成商業化品種GK19；也可以獲得插入棉花第26 染色體的轉化事件,育成商業化品種33B。

3.2 不同基因定位方法的特色

棉花經典遺傳學的定位方法是使用顯性遺傳多基因系T586 和隱性遺傳多基因系T582,通過配置雜交組合,對雜交后代目標性狀的連鎖關系進行分析,以實現突變基因(或外源基因)的染色體定位。由于以上2 個遺傳系連鎖的形態標記基因數太少,未能覆蓋陸地棉所有染色體,因此連鎖定位成功的幾率極低。

利用目標基因組步行PCR[16]、TAIL-PCR[17]、hiTAIL- PCR[18]等結合全基因組序列對外源目的基因進行測序定位,從理論上說是比較容易獲得特定外源基因插入染色體的精確位置,從而實現對外源基因的染色體定位[19]。但實際上,外源基因導入棉花受體后,其旁側翼序列會產生一些不可預知的DNA 序列結構變化[20]；尤其是陸地棉基因組大而復雜,不同陸地棉材料的基因序列也不盡相同。因此,盡管在陸地棉中獲得許多轉基因事件,但利用測序方法獲得棉花外源基因準確定位的公開報道并不多見。比如西南大學2012年對外公開發放了中國轉iaaM基因棉花,棉花全基因組測序結果也相繼公布[21-22]；但迄今未見iaaM基因被測序定位的公開報道。這顯示利用TAIL-PCR等方法結合棉花全基因組序列對外源目的基因進行測序定位,在實際應用中仍有很大的復雜性。

董志強等[23]對轉Bt基因抗蟲棉GK-12 的Bt毒蛋白進行亞細胞結構的定位試驗顯示,轉Bt基因抗蟲棉的外源晶體毒蛋白取向性定位在細胞器葉綠體以及前體中。至于Bt基因的染色體定位,肖松華等[24]使用經典遺傳學的方法,試圖對中國抗蟲棉GK-12 與美國抗蟲棉33B 的Bt基因進行基因定位,但均未成功。近年來,本實驗室依據Guo 等[25]、Zhao 等[26]公布的四倍體棉花分子標記遺傳圖譜,并利用自主篩選的相對均勻分布于棉花26 對染色體上的234 對SSR核心引物,已成功對多個外源基因進行染色體定位[27-29]。這一定位方法是通過目的基因與特定染色體的多個SSR 分子標記連鎖關聯分析,其定位結果相當于多次連鎖重復驗證,具有極高的可靠性。對于棉花育種的應用者來說,這種定位結果可以有效指導育種者根據孟德爾的基因獨立遺傳或連鎖遺傳規律,依據育種目標來配置不同的雜交組合,從而有目的地實現不同外源基因的互補與整合。