土貝母苷甲對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖、凋亡、自噬的影響

劉付鋒，張亞偉，孫遠遠，陳景景，宋早智，劉號峰，劉永紅，趙士弟，金功圣

(1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，安徽蚌埠233000；2福建醫(yī)科大學附屬軍區(qū)總醫(yī)院；3杭州市臨安區(qū)第一人民醫(yī)院；4杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤[1]，主要治療策略是手術和輔助化療。由于難以設計個體化治療，乳腺癌患者的臨床管理也是一個巨大挑戰(zhàn)，耐藥性和劑量限制性毒性都可能影響治療效果和預后。因此，迫切需要開發(fā)新的、不良反應更小的藥物來改善患者的生存質量。天然藥物因其低毒性和高生物活性被廣泛應用于臨床醫(yī)學研究[2]。土貝母苷甲是從中藥南蛇藤(葫蘆科)塊莖中分離得到的一種天然化合物。據(jù)報道其有廣泛的生物學作用，包括抗炎、抗病毒、免疫抑制等[3]。越來越多的證據(jù)表明，土貝母苷甲具有顯著的抗腫瘤作用，可抑制細胞增殖，阻滯細胞周期，促進人食管鱗癌(KYSE520)、絨毛膜癌(JEG-3)、肺癌(NCI-H292)及鼻咽癌(CNE-2Z)細胞自噬[4]，有望成為一種新的抗癌藥物成分。然而，土貝母苷甲對人乳腺癌細胞的作用仍不清楚。因此，本研究觀察了土貝母苷甲對人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖、凋亡、自噬的影響，并探討其潛在的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要材料 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自中科院上海細胞庫，加入含10%胎牛血清、5%青霉素的DMEM高糖溶液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。土貝母苷甲標準品購于大連美侖科技有限公司，純度>98%，使用DMEM培養(yǎng)液溶解成100 μg/mL儲存液，于-20 ℃避光保存。胎牛血清購自德國Clark公司。DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司。CCK-8試劑盒、Annexin v-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、Western blotting所用配膠試劑盒、蛋白測定試劑盒均購自碧云天生物科技公司。受體相互作用蛋白激酶1(RIP1)、自噬標志物LC3、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶(Akt)B和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)一抗及羊抗兔二抗均購自美國CST公司。帶熒光標記的熒光二抗為博士德公司產(chǎn)品。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)購自大連美侖生物科技公司。

1.2 土貝母苷甲對乳腺癌細胞增殖的影響觀察 將含100 μg/mL土貝母苷甲的DMEM儲存液稀釋成5、10、15、20、25、30 μg/mL。96孔板中細胞生長密度達到80%時，進行加藥處理。設置調(diào)零孔(只加培養(yǎng)液)、對照孔(不加藥物)及5、10、15、20、25、30 μg/mL土貝母苷甲孔，每組5個復孔。待給藥48 h后，棄去含土貝母苷甲的MDEM培養(yǎng)液。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，置于37 ℃搖床下孵育1 h。酶標儀上檢測450 nm波長下的OD值。細胞存活率=(實驗孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照孔OD值-調(diào)零孔OD值)×100%。

1.3 土貝母苷甲對乳腺癌細胞凋亡的影響觀察

1.3.1 細胞凋亡率測算 將乳腺癌細胞接種于6孔板，當細胞生長密度達到80%時，分為對照組和5、10、20 μg/mL土貝母苷甲組。給藥48 h后，消化、離心，收集6孔板中的細胞到15 mL離心管中，加入適量PBS重懸細胞2次。將重懸后的細胞移到流式管中，每管加入500 μL的結合液(Binding buffer)。充分混勻后依次加入5 μL的Annexin V-FITC及5 μL的PI染色液。在半小時內(nèi)完成上機檢測，F(xiàn)low J軟件分析并計算細胞凋亡率。

1.3.2 細胞凋亡類型分析 選取生長狀態(tài)好的兩瓶MDA-MB-231細胞，一瓶不進行特殊處理，另一瓶加入含有20 μg/mL土貝母苷甲的DMEM溶液，處理24 h。收集細胞，12 000 r/min離心10 min，去上清液，預冷PBS重懸細胞沉淀3次。加入1 mL的2.5%戊二醛固定液，在電子透射顯微鏡下觀察細胞超微結構并拍照。

1.4 土貝母苷甲對乳腺癌細胞自噬、凋亡及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響觀察 細胞分組處理參照“1.3.1”。采用Western blotting法檢測各組細胞中的自噬相關蛋白LC3、凋亡相關蛋白RIP1、PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白PI3K、Akt、p-Akt、P62和p-mTOR。用裂解液裂解各組細胞總蛋白；蛋白定量后行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉至PVDF膜；RIP1、LC3、PI3K、p-Akt、p-mTOR一抗4 ℃孵育過夜后加入羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h；凝膠成像系統(tǒng)ECL成像；用Image J軟件分析各組條帶灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.5 3-MA對土貝母苷甲誘導自噬的影響觀察 將乳腺癌細胞分為對照組、3-MA組、土貝母苷甲組、土貝母苷甲+3-MA組。對照組不加入藥物，3-MA組加入10 mmol/L的3-MA，土貝母苷甲組加入20 μg/mL的土貝母苷甲，土貝母苷甲+3-MA組加入10 mmol/L的3-MA和20 μg/mL的土貝母苷甲。各組培養(yǎng)24 h后，提取細胞總蛋白，采用Western blotting法檢測細胞中的LC3、p-Akt蛋白。

2 結果

2.1 土貝母苷甲對乳腺癌細胞增殖的影響 對照組及5、10、15、20、25、30 μg/mL土貝母苷甲組細胞存活率分別為100.0%±0.7%、93.7%±2.2%、88.6%±2.7%、82.3%±4.7%、64.9%±3.8%、43.4%±5.3%、23.8%±3.7%，各組細胞存活率依次下降(P均<0.01)。

2.2 土貝母苷甲對乳腺癌細胞凋亡的影響 對照組及5、10、20 μg/mL土貝母苷甲組細胞凋亡率分別為5.3%±0.7%、9.8%±1.8%、17.8%±3.4%、37.9%±3.1%，各組細胞凋亡率依次增高(P均<0.05)。透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細胞內(nèi)形成吞噬泡，大量單層膜構成的自噬體和自噬溶酶體顯著蓄積；高爾基體和內(nèi)質網(wǎng)等細胞器膨脹；胞質無定形，核碎斷、固縮；可見內(nèi)質網(wǎng)包圍將要被吞噬的底物，隨后與初級溶酶體結合形成囊泡，可見細胞膜出泡現(xiàn)象。

2.3 土貝母苷甲對乳腺癌細胞自噬、凋亡、PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響 對照組及5、10、20 μg/mL土貝母苷甲組細胞中RIP1、LC3蛋白相對表達量依次增加(P均<0.01)，PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達量依次降低(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組乳腺癌細胞中LC3、RIP1、PI3K、Akt、p-Akt、p-mTOR蛋白表達比較

注：與對照組相比，*P<0.05;與5 μg/mL土貝母苷甲組相比，#P<0.05;與10 μg/mL土貝母苷甲組相比，△P<0.05。

2.4 3-MA對土貝母苷甲誘導自噬的影響 對照組、3-MA組、土貝母苷甲組、土貝母苷甲+3-MA組的LC3蛋白相對表達量分別為1.02±0.07、0.93±0.06、1.49±0.16、1.22±0.07，土貝母苷甲+3-MA組LC3蛋白表達低于土貝母苷甲組(P<0.05)；p-Akt蛋白相對表達量分別為1.04±0.02、1.65±0.09、0.68±0.14、0.84±0.11，3-MA組、土貝母苷甲+3-MA組p-Akt蛋白表達高于土貝母苷甲組(P均<0.05)。

3 討論

自然界中存在許多具有生物活性的三萜皂苷類化合物。多項研究表明，皂甙化合物通過調(diào)節(jié)凋亡、自噬等抑制腫瘤細胞增殖、血管生成及轉移[5]。皂甙化合物可靶向作用于腫瘤的多種信號通路，顯示出潛在的抗腫瘤特性[6]。許多皂苷合成的化合物如柴胡、人參、三七、甘草和黃芪等已經(jīng)在臨床中使用，并且有極大的前景[7]。本研究將皂苷類提取物土貝母苷甲作用于人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231，發(fā)現(xiàn)隨著土貝母苷甲作用濃度增高，乳腺癌細胞存活率下降、凋亡率增高，提示土貝母苷甲可抑制乳腺癌細胞增殖并促使其凋亡，作用呈劑量依賴性。

細胞凋亡是由抗癌化療藥物誘發(fā)的一種重要的細胞死亡過程，其特征是細胞皺縮、細胞核破裂和凋亡小體形成。RIP1是構成凋亡小體的核心成分[8]。本研究結果顯示，隨著土貝母苷甲作用濃度升高，凋亡關鍵蛋白RIP1表達增加，提示土貝母苷甲誘導了RIP1依賴性的細胞凋亡。為了分析土貝母苷甲誘導細胞凋亡的類型，本課題組進行了細胞超微結構觀察，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細胞內(nèi)形成吞噬泡，大量單層膜構成的自噬體和自噬溶酶體顯著蓄積，高爾基體和內(nèi)質網(wǎng)等細胞器膨脹，胞質無定形，核碎裂、固縮，可見細胞膜出泡現(xiàn)象，上述結果表明土貝母苷甲誘導MDA-MB-231細胞發(fā)生了自噬。

細胞自噬又稱為Ⅱ型細胞死亡，是細胞在自噬相關基因的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程。發(fā)生自噬的細胞內(nèi)可見自噬體空泡結構，包括自噬體、自噬溶酶體、自噬體與溶酶體融合的產(chǎn)物。自噬體的合成、自噬底物的吞噬、自噬溶酶體成熟及溶酶體水解酶對物質降解的過程為自噬流[9]。通過這些過程，不必要的細胞質蛋白和細胞器將被清除，實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新[10,11]。各種方式的自噬在生理狀態(tài)下是細胞的“管家”，可維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，促進細胞存活[12]。然而，在疾病狀態(tài)下，自噬成為一把“雙刃劍”，自噬過度可誘導細胞向凋亡轉化，共同促進細胞死亡[13]。許多研究表明，過度激活的自噬能夠促進腫瘤細胞死亡，這是自噬介導腫瘤細胞死亡的潛在機制。本研究結果顯示，土貝母苷甲作用后，MDA-MB-231細胞中自噬相關蛋白LC3相對表達量顯著增加，進一步表明土貝母苷甲誘導MDA-MB-231細胞死亡是通過自噬介導的。

研究[14]表明，PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路異常激活后可誘導腫瘤發(fā)生，這個過程有細胞增殖和自噬參與。PI3K/Akt信號通路的異常激活也被證實在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[15]。PI3K-Akt-mTOR通路激活可抑制細胞自噬，該途徑失活則誘導自噬。Akt是PI3K-Akt信號通路中的主要介質。mTOR是PI3K-Akt通路的下游靶點[16]。多項研究表明，自噬過程受mTOR的激活負性調(diào)控[18]。自噬過程中，PI3K的活性對自噬體形成早期的成核和組裝是必須的。在自噬過程中，溶酶體降解自噬體會導致P62水平降低。本研究中，土貝母苷甲處理的MDA-MB-231細胞中P62、PI3K、Akt、p-Akt、P62、p-mTOR的表達呈劑量依賴性下降，提示土貝母苷甲誘導自噬可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路實現(xiàn)的。

自噬抑制劑3-MA可通過抑制PI3K的作用來阻斷自噬[17]。3-MA同時通過增加溶酶體堿性，破壞溶酶體功能，進而抑制自噬發(fā)生。本課題組用3-MA預處理MDA-MB-231細胞以進一步明確土貝母苷甲是否誘導自噬，結果顯示PI3K抑制劑3-MA顯著緩解了細胞中p-Akt蛋白水平下降趨勢，推測土貝母苷甲誘導自噬的機制與下調(diào)Akt活性有關。抑制PI3K-Akt-mTOR途徑是土貝母苷甲誘導過度自噬的原因，也是自噬調(diào)節(jié)的經(jīng)典途徑。

綜上所述，土貝母苷甲可抑制乳腺癌細胞增殖、促進其凋亡并誘導細胞自噬，土貝母苷甲的自噬誘導作用可能是通過調(diào)節(jié)PI3k-Akt-mTOR信號通路實現(xiàn)的。上述研究結論為三萜皂苷類化合物治療惡性腫瘤的臨床試驗提供了理論基礎。