高效液相色譜法測(cè)定通絡(luò)通散中柯里拉京的含量

梁瑩瑩 ，李 麗 ，赫 軍 ，張淑君 ，馬秉智 ，王曉雪 ，劉 曉 ★

（1.中日友好醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100029；2.北京工商大學(xué) 北京市植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

通絡(luò)通方為我院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科常用的中藥驗(yàn)方，外用具有溫經(jīng)通絡(luò)、活血化瘀之功效，能顯著改善化療引起的病理性神經(jīng)性疼痛[1～3]。通絡(luò)通散是對(duì)該驗(yàn)方進(jìn)行二次開(kāi)發(fā)后研制的制劑，由老鸛草、淫羊藿、紅花等中藥組成，制成散劑，方便患者攜帶[4]。老鸛草作為方中的君藥，其藥材通用檢測(cè)成分為沒(méi)食子酸。但經(jīng)過(guò)初步試驗(yàn)結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸在該處方分析中存在干擾，而柯里拉京是其特征性成分[5]，專屬性強(qiáng)，能作為該制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)，故本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)其制劑的指標(biāo)性成分柯里拉京進(jìn)行含量測(cè)定，為通絡(luò)通散質(zhì)量控制方法的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀，CPA225D十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)斯多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

通絡(luò)通散（批號(hào) 20150123、20150205、20150219）為中日友好醫(yī)院中藥制劑室自制；柯里拉京（批號(hào)：111623-201308）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。試驗(yàn)中所用乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[6，7]與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱為 Waters Symmetry C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.01mol/L 磷酸氫二鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié) pH 至 2.14）（9：91，V/V）；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μl。在上述色譜條件下，柯里拉京的保留時(shí)間為10.4min，組分分離良好，且其它成分無(wú)干擾。理論板數(shù)以柯里拉京峰計(jì)≥5000；分離度＞1.5。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取15.79mg柯里拉京對(duì)照品，置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取本品0.1g，置于50ml具塞錐形瓶中，精密加入50%丙酮溶液10ml，稱定重量，超聲（功率：240W）提取0.5h，放冷，再稱定重量，用50%丙酮溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

取不含老鸛草的其他藥味各適量，按通絡(luò)通散的處方比例及制備工藝制成缺老鸛草的陰性樣品，再按“2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下柯里拉京對(duì)照品溶液 0.5ml、1ml、2ml、4ml、8ml置于 10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列對(duì)照品溶液。分別精密吸取系列對(duì)照品溶液各10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以柯里拉京的峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（，μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=40754.3736x-47.6917，r=0.9999。結(jié)果表明，柯里拉京的質(zhì)量濃度在7.90～505.28μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2 3個(gè)不同批號(hào)通絡(luò)通散中柯里拉京的含量（n=3）

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一柯里拉京對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果RSD為1.46%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取通絡(luò)通散置于50ml具塞錐形瓶中，按 “2.3”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，于制備后0，2，4，6，8，10，12 h 時(shí)分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄柯里拉京峰面積，結(jié)果RSD為0.97%（n=6），表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取通絡(luò)通散置于50ml具塞錐形瓶中，按“2.3”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，共制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定柯里拉京的含量，結(jié)果平均含量為 4.57mg/g，RSD 為 1.38%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知柯里拉京含量的通絡(luò)通散適量，共6份，分別精密加入相當(dāng)量的柯里拉京對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.10 樣品含量測(cè)定

分別精密稱取不同批號(hào)的通絡(luò)通散約0.1g，各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中柯里拉京的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

通絡(luò)通散為我院在研制劑，老鸛草為方中君藥，柯里拉京是其特征性成分，專屬性強(qiáng)，能作為該制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。柯里拉京具有抗癌活性，其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌等作用機(jī)理研究確切[8～11]，可以確定其為活性成分。但老鸛草成分復(fù)雜，通絡(luò)通散作為復(fù)方制劑，其藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)尚待進(jìn)一步研究，尚不能以偏概全，以柯里拉京為本制劑的全部有效成分。本實(shí)驗(yàn)選取了老鸛草主要特征成分柯里拉京作為質(zhì)量控制指標(biāo)，建立了通絡(luò)通散中柯里拉京的含量測(cè)定方法。通過(guò)紫外光譜掃描發(fā)現(xiàn)，柯里拉京的最大吸收波長(zhǎng)在220nm處，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]，故選用220nm為檢測(cè)波長(zhǎng)；關(guān)于提取方法，由于制劑中其它組分對(duì)柯里拉京的干擾較大，故筆者參照文獻(xiàn)[2]，分別考察了烘干后甲醇提取、50%甲醇提取和50%丙酮提取3種方法，結(jié)果表明50%丙酮提取能有效除去雜質(zhì)，排除干擾，對(duì)柯里拉京的提取率高，重現(xiàn)性好，便于醫(yī)院制劑的常規(guī)檢驗(yàn)工作，為最佳提取方法。