葫蘆巴丸加減方對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠相關(guān)神經(jīng)生長因子的影響

王乾平 ，王鐵楓 ，劉雁峰 ★

（1.中日友好醫(yī)院 中醫(yī)婦科，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 東直門醫(yī)院 婦科，北京 100700）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，ENT）以下簡稱內(nèi)異癥，是指具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆內(nèi)膜以外的身體其他部位而引起的，以進(jìn)行性痛經(jīng)、性交痛、不孕、月經(jīng)異常等為主要癥狀的疾病。它是育齡婦女的多發(fā)病、常見病。

內(nèi)異癥在中醫(yī)學(xué)屬 “痛經(jīng)”、“癥瘕”、“月經(jīng)不調(diào)”、“不孕”等范疇。北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院肖承悰教授在多年的臨床實踐中總結(jié)出 “陽氣不足，寒凝血瘀”是本病的重要病機(jī)之一，因此主張臨床治療內(nèi)異癥時應(yīng)溫通并重，扶正與祛瘀并舉。肖老選用宋代《太平惠民和劑局方》所載葫蘆巴丸為基礎(chǔ)方隨癥加減治療內(nèi)異癥，取得了良好的臨床療效。本研究通過建立內(nèi)異癥大鼠模型，觀察葫蘆巴丸加減方對相關(guān)神經(jīng)生長因子表達(dá)的影響，探討內(nèi)異癥神經(jīng)源性相關(guān)的發(fā)病機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物

選擇 7～8周齡無病原體級（specificpathogen，SPF）雌性 SD大鼠54只，性成熟，未經(jīng)交配生育，體重200±10g。購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0011。實驗動物飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院生物安全Ⅱ級實驗室，室溫 25±1℃，相對濕度 50%～60%，光照明暗各12h，自由攝食水。

1.2 主要藥品和試劑

葫蘆巴丸加減方顆粒劑，具體藥物組成：葫蘆巴、巴戟天、吳茱萸、小茴香、郁金、片姜黃、莪術(shù)、王不留行等。購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院草藥房。

對照藥物為孕三烯酮（內(nèi)美通，2.5mg/粒），購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院西藥房。產(chǎn)品批號：531604011。將孕三烯酮（內(nèi)美通，2.5mg/粒）溶于50ml的溫蒸餾水中，玻璃棒攪拌混勻，濃度為0.05g/ml，置于4℃冰箱備用。

主要試劑：乙醇、二甲苯、磷酸鹽緩沖液（PBS）、3%雙氧水、 中性樹膠、DAB顯色試劑、兔超敏二步法免疫組化試劑盒（北京中山金橋生物科技有限公司）、一抗大鼠NGF、trkA、p75 NTR單克隆抗體（英國Abcam公司）。

1.3 主要儀器和設(shè)備

石蠟切片機(jī)、脫水機(jī)、展片機(jī)（德國LEICA公司），生物組織包埋機(jī)（孝感宏業(yè)醫(yī)用器械有限公司），微波爐（廣州美的有限公司），-80℃冰箱（美國Thermo公司）。

2 方法

2.1 分組

按照隨機(jī)表法，共分為6組，分別為假手術(shù)組、空白模型組、陽性藥物對照組（孕三烯酮組）、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組9只大鼠。除假手術(shù)組外，其余5組均按照自體移植方法建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型。

2.2 動物造模

采用自體移植法進(jìn)行造模[1]：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，陰道涂片觀察，連續(xù)2個以上的規(guī)律動情周期后開始造模。造模前24h給造模組大鼠戊酸雌二醇0.2mg/只灌胃以誘導(dǎo)大鼠發(fā)情，開腹剪取大鼠右側(cè)子宮角約1cm長的一段，迅速置于盛有0.9%生理鹽水的培養(yǎng)皿中，將子宮斷端行端端縫合。從剪下的子宮段切取1.0cm×0.5cm大小的一塊，以內(nèi)膜面貼向左側(cè)腹膜血管豐富處，縫合四角，關(guān)腹。術(shù)后常規(guī)抗感染處理。4周后模型復(fù)制成功。

2.3 給藥

各組大鼠造模后4周進(jìn)行灌胃，假手術(shù)組和空白模型組每日灌服生理鹽水10ml/kg；中藥低、中、高劑量組大鼠每日分別按4.4g/kg、8.8g/kg、17.6g/kg生藥量灌服葫蘆巴丸加減方；西藥組灌服孕三烯酮混懸液0.25mg/kg，2次/周，其余時間灌服等量生理鹽水。各組大鼠每日固定時間給藥，連續(xù)4周。

給藥劑量根據(jù)“千克體重劑量換算公式”[2]計算：Db=Da·Rab；Rab=（ka/kb）·（wa/wb）/3。

因此，小鼠等劑量的給藥量為臨床成人用藥量 6 倍。中藥劑量（中劑量組）按 8.8g/（kg·d）給藥。孕三烯酮組按 0.25mg/（kg·d）給藥；模型組及正常組予生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥4周，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

2.4 標(biāo)本制備

給藥治療4周即最后1次灌胃結(jié)束后次日，麻醉大鼠進(jìn)行剖腹以獲取子宮內(nèi)膜異位組織。將大鼠置于冰上，剪取大鼠腹壁處形成囊泡的子宮內(nèi)膜異位組織，放入4%多聚甲醛中固定，用于免疫組化檢測。

2.5 免疫組化法檢測樣本

采用免疫組化法檢測在位和異位內(nèi)膜中神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、絡(luò)氨酸激酶（tyrosinekinase，trkA）、p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體（p75neurotrophin receptor，P75NTR）指標(biāo)的表達(dá)。將樣本石蠟固定，縱切為厚度約5um的切片，然后進(jìn)行免疫組化染色。具體石蠟切片流程如下：梯度酒精脫水、二甲苯浸泡、石蠟浸泡、石蠟包埋、切片、烤片。二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）各10min，100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、超純水各5min脫蠟。檸檬酸鹽抗原修復(fù)，H2O2封閉，血清封閉，加一抗、滴PBS稀釋（NGF、trkA、P75 NTR的稀釋比例均為1:100），4℃孵育過夜；次日甩干后二抗孵育，DAB顯色，蘇木素染核，酒精鹽酸分色，脫水封片。最后，光學(xué)顯微鏡下拍片，Image-pro軟件計算染色結(jié)果，檢測圖像積分光密度（IOD值），比較免疫組化的強(qiáng)弱。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較若符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析（One Way ANOVA），組間兩兩比較若方差齊，采用Tukey-Kramer方法，若方差不齊，采用Games-Howell法。

3 結(jié)果

3.1 葫蘆巴加減方對內(nèi)異癥大鼠NGF蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組和各藥物組NGF的表達(dá)量均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥各組均明顯降低（P＜0.01）；中藥各組比較，中藥組中劑量組NGF表達(dá)最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果說明，中藥可以有效降低異位內(nèi)膜NGF蛋白表達(dá)水平。見表1、圖1（封底）。

3.2 葫蘆巴加減方對內(nèi)異癥大鼠trkA相對蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組和各藥物組trkA的表達(dá)量均增高（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥各組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥各組之間比較，無明顯差異（P＞0.05）。見表1、圖2（封底）。

3.3 葫蘆巴加減方對內(nèi)異癥大鼠 p75 NTR相對蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組和各藥物組P75 NTR 的表達(dá)量均增高（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥各組均明顯降低，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.01）；中藥各組比較，中藥組中劑量組P75 NTR 表達(dá)最低（P＜0.05）。結(jié)果說明，中藥可以有效降低異位內(nèi)膜P75 NTR蛋白表達(dá)水平。結(jié)果見表1、圖3（封底）。

4 討論

內(nèi)異癥病因復(fù)雜，始終是國內(nèi)外婦科領(lǐng)域研究熱點，Sampson提出經(jīng)典的“經(jīng)血逆流”學(xué)說以后，在位內(nèi)膜決定論、體腔上皮化生、血管及淋巴轉(zhuǎn)移學(xué)說以及干細(xì)胞理論等其發(fā)病相關(guān)的因素也陸續(xù)被提出，同時，相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控異常、免疫炎癥反應(yīng)以及性激素受體表達(dá)異常等與內(nèi)異癥的發(fā)生也密切相關(guān)。而引起內(nèi)異癥復(fù)雜的疼痛癥狀則與病變類型及部位有關(guān)，深部浸潤型內(nèi)異癥疼痛程度最重，其疼痛的發(fā)生主要與神經(jīng)解剖機(jī)制、雌激素高敏感性、盆腔炎性因子的影響等因素有關(guān)。目前，神經(jīng)解剖機(jī)制是內(nèi)異癥疼痛發(fā)病機(jī)制中最熱門的研究領(lǐng)域[3～5]。

內(nèi)異癥患者體內(nèi)存在神經(jīng)纖維的異常分布，分布密度與患者的疼痛嚴(yán)重程度密切相關(guān)，且內(nèi)異癥患者病灶內(nèi)的高神經(jīng)纖維分布與其神經(jīng)因子高表達(dá)相伴出現(xiàn)[6，7]。Arnold等[8]報道內(nèi)異癥腹膜病灶中交感神經(jīng)纖維密度降低而感覺神經(jīng)纖維密度增加，兩種神經(jīng)纖維的比例失衡，可能與內(nèi)異癥疼痛的發(fā)生有關(guān)。內(nèi)異癥患者病灶內(nèi)的高神經(jīng)纖維分布與其神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophin，NT）高表達(dá)相伴出現(xiàn)。

國內(nèi)目前對NGF及其受體與子宮腺肌病痛經(jīng)關(guān)系有初步探討。有研究表明，神經(jīng)生長因子通過其受體介導(dǎo)，可提高神經(jīng)纖維的敏感性和雌激素受體的表達(dá)，引起子宮收縮和對疼痛的敏感[9]。有實驗表明TrkA在子宮腺肌病痛經(jīng)患者異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中廣泛表達(dá)，在子宮腺肌病發(fā)病及痛經(jīng)的發(fā)生中起重要作用，該實驗認(rèn)為子宮腺肌病痛經(jīng)的發(fā)生與子宮內(nèi)膜NGF表達(dá)增加有關(guān)[10]。李曉燕等[11]對腹腔鏡術(shù)后28例內(nèi)異癥患者及10例非內(nèi)異癥患者進(jìn)行臨床觀察，發(fā)現(xiàn)P75NTR可能參與內(nèi)異癥的發(fā)病，NGF及其受體P75 NTR在在位內(nèi)膜中的表達(dá)與疼痛相關(guān)，表明其可能參與了內(nèi)異癥疼痛發(fā)病機(jī)制。研究表明NGF和其受體trkA和P75NTR在子宮內(nèi)膜異位癥患者中的表達(dá)和盆腔疼痛密切相關(guān)。而其中NGF的表達(dá)強(qiáng)度和血清中雌激素濃度密切相關(guān)[12]。同時，孕激素能夠拮抗雌激素作用，從而抑制NGF表達(dá)[13]。另有研究說明，孕激素可以減弱異位內(nèi)膜中trkA和P75NTR的表達(dá)[14]。孕三烯酮為孕激素類藥物，臨床用于治療內(nèi)異癥，結(jié)合藥理作用，選擇其作為陽性對照藥物。

表1 異位內(nèi)膜NGF、trkA和p75 NTR相對蛋白表達(dá)水平（±s）

表1 異位內(nèi)膜NGF、trkA和p75 NTR相對蛋白表達(dá)水平（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，與模型組比較，##P＜0.01，#P＜0.05。

分組 NGF trkA P75NTR假手術(shù)組（空白組）（n=9）1614047±191350## 29855±3486# 1834047±121340#模型組（n=9）7668541±106908* 75950±2585* 7738521±112608*西藥組（n=9）4033076±525020*## 40145±3667#* 4235016±427023*#中藥低劑量組（n=9）3624970±187000*## 42856±3073#* 3728975±177663*#中藥中劑量組（n=9）2889370±127892*## 40908±1092#* 2983370±167872*#中藥高劑量組（n=9）3742795±108346*## 38925±853#* 3682776±156342*#

本研究結(jié)果表明,內(nèi)異癥大鼠異位內(nèi)膜中NGF、trkA、P75NTR的相對蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組（假手術(shù)組）。說明神經(jīng)生長因子NGF、trkA、P75NTR可能參與了內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展過程。同時，本研究證實葫蘆巴丸加減方可以有效降低異位內(nèi)膜NGF、trkA、P75NTR的表達(dá)水平。葫蘆巴丸加減方共8味藥，葫蘆巴溫腎助陽、祛寒止痛，起到標(biāo)本兼治的作用；巴戟天助葫蘆巴補(bǔ)腎溫陽；小茴香、吳茱萸具散寒止痛之功效；郁金可活血止痛、行氣解郁；莪術(shù)、片姜黃則破血以行氣，王不留行起活血通經(jīng)之功效。全方共奏溫陽散寒、祛瘀通脈、行氣止痛之功效。這些藥物成分可以有效抑制神經(jīng)生長因子NGF、trkA、P75NTR的蛋白表達(dá)水平，從而抑制內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展過程。

NGF、P75NTR的蛋白表達(dá)水平，在中藥治療低、中、高劑量組間比較，中劑量組的結(jié)果優(yōu)于低、高劑量組。可見，給藥濃度和NGF、P75NTR的蛋白表達(dá)的關(guān)系并不是隨藥物濃度改變的線性關(guān)系，這說明藥物濃度并非越高越好，合適的用藥劑量才能帶來最優(yōu)療效。我們推測，藥物是通過和一些受體結(jié)合來產(chǎn)生效應(yīng)的，隨著劑量的增加，和受體結(jié)合而產(chǎn)生的效應(yīng)增加，但隨著受體和藥物結(jié)合出現(xiàn)飽和，導(dǎo)致治療效應(yīng)不再繼續(xù)上升，此時藥物劑量繼續(xù)增加不但不能提高療效，反而由于過高濃度帶來的毒副作用影響，降低了療效。因此，葫蘆巴丸的用藥劑量對于子宮內(nèi)膜異位癥的治療是十分關(guān)鍵的。