解脲支原體生物亞群及抗子宮內膜抗體與女性不孕的相關性研究

曾文軍　王柳均　梅艷娟　鄧珍良　皮紅泉　陳群

【摘要】 目的：探討解脲支原體（UU）不同生物亞群、抗子宮內膜抗體（AEMAb）與女性不孕患者的關系。方法：選取本院2017年2月-2018年2月100例不孕女性為不孕組，同期選取100例健康孕婦為對照組，兩組均行UU培養，通過聚合酶鏈反應并以多條帶抗原基因為靶位設計引物將檢測到的UU進行分群，應用ELISA方法檢測AEMAb，同時進行相關分析。結果：不孕組UU及其UU2生物亞群與AEMAb陽性率均明顯高于對照組（P<0.01），不孕組以UU2生物亞群為主，對照組以UU1生物亞群為主，而兩組UU1生物亞群比較差異無統計學意義（P>0.05）。不孕組AEMAb陽性者UU及UU2生物亞群感染率明顯高于AEMAb陰性者（P<0.01），兩者UU1生物亞群比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論：女性不孕的發生與UU及AEMAb有關，UU1生物亞群可能是定植菌群，而UU2生物亞群則更易導致機體產生AEMAb引起不育。

【關鍵詞】 解脲支原體; 生物亞群; 抗子宮內膜抗體; 聚合酶鏈反應; 不孕

【Abstract】 Objective：To study the association between biovars of ureaplasma urealyticum （UU） and antiendometrium antibody（AEMAb） in infertile women.Method：100 infertile women in our hospital from February 2017 to February 2018 were selected as infertile group，at the same time 100 healthy pregnant women were selected as control group，they were given UU cultured.The detected UU was grouped by polymerase chain reaction and primers were designed with multiple antigen genes as targets.AEMAb was detected by ELISA，and the correlation analysis was carried out.Result：There were significant differences in positive rate of UU，UU2 and AEMAb between infertility group and control group（P<0.01）.Biovar UU1 was the main biovar in control group and infertility group were mainly infected with biovar UU2.No significant difference was found in biovar UU1 between two groups（P>0.05）.The positive rate of AEMAb in positive UU and biovar UU2 were significantly higher than that of negative rate of AEMAb（P<0.01），but biovar UU1 was no significant difference in infertility group（P>0.05）.Conclusion：It is suggested that infertile women is closely correlated with UU and AEMAb;UU1 is the colonized biovar，UU2 may be cause infertility easily because of inducing AEMAb.

【Key words】 Ureaplasma urealyticum; Biovars subgroup; Antiendometrium antibody; Polymerase chain reaction; Infertility

First-authors address：Dongguan Changping Hospital Affiliated of Jinan Universty，Dongguan 523573，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.01.035

解脲支原體（UU）是女性宮頸寄居最常見的微生物之一，具有一定的致病性，按照不同的生物表型及基因特征分為UU1（即Parvo生物群，包括1、3、6、14四種血清型）與UU2（即T960生物群，包括2、4、5、7-13十種血清型）兩種生物亞群，而且不同的生物亞群可能與宮頸盆腔炎癥、不孕不育、早產流產、新生兒肺炎有關[1]。抗子宮內膜抗體（AEMAb）是以子宮內膜為靶抗原并引起一系列免疫反應的自身抗體，與免疫性不孕關系密切，它的產生有諸多學說，但生殖道微生物感染是誘因之一[2]。本研究采用分子生物學檢測UU不同生物亞群及AEMAb與女性不孕關系，旨在為臨床診治及優生優育提供一定依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2017年2月-2018年2月符合女性不孕標準（未采取避孕措施正常同居2年以上而未妊娠）患者100例為不孕組，年齡22～40歲，平均（29.1±4.2）歲。（1）納入標準：①無器質性病變;②夫妻生活正常;③月經正常;④配偶精液正常。（2）排除標準：①其他細菌及病毒感染;②遺傳性疾病、先天不育不孕及排卵障礙;③外傷及手術史、嚴重內科疾患、癌癥病史;④配偶精液異常。選取本院同時期具有可比性的100例健康孕婦為對照組，年齡23～41歲，平均（28.9±3.9）歲（P>0.05）。參與者均知曉同意并簽署知情同意書，且該研究通過本院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 主要試劑及儀器 SU-CF-IF型凈化工作臺，PCR儀，電熱恒溫水箱，Clinibio 128C酶標儀，國產洗板機，紫外線燈，UU液體及固體培養基，UU3（UU1生物亞群）及UU8（UU2生物亞群）標準菌株。PCR反應試劑盒及DNA marker，DNA引物，瓊脂糖，AEMAb試劑。

1.3 AEMAb檢測 采用ELISA法檢測，空腹抽取靜脈血3 mL分離血清-20 ℃保存備用。測定時血清作1︰100稀釋，加稀釋血清100 μL至包被孔內，并作陰陽性對照各一孔，經溫浴、洗滌、顯色等步驟，最后加終止液終止顯色，450 nm波長酶標儀測定各孔光密度（OD）值。P/N≥2.1者為陽性（P：待測血清OD值，N：陰性對照OD值。當N<0.1時，則以0.1計）。

1.4 UU檢測培養及生物群鑒定 （1）UU檢測培養：收集宮頸拭子標本，經分離、純化、鑒定、培養增殖后置-20 ℃醫用冰箱備用。（2）菌株DNA提取：自醫用冰箱中取出臨床標本與標準菌株，解凍后吸取500 μL液體，10 000 r/min離心15 min，吸取上清液;加入100 μL的蛋白酶K溶液;55 ℃水浴1 h;95 ℃保溫滅活蛋白酶K 10 min;10 000 r/min?離心1 min，取上清液作PCR。（3）PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳：以多條帶抗原基因為靶位設計分群引物進行鑒定，并設空白對照。UU分群引物上游為5-GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG-3;下游為5-CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAATTC-3。UU1及UU2生物亞群擴增產物分別為403 bp、448 bp。PCR反應體系為20 μM引物各2 μL，3 U/μL Taq酶1 μL，10×PCR Buffer （含Mg2+）5 μL，3 mM dNTP，混合物5 μL，DNA模板3 μL，ddH2O?40 μL，總反應體積100 μL。PCR反應設為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40個循環，擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定[3]。

1.5 統計學處理 使用SPSS 18.0統計軟件處理，計量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用率（%）表示，組間比較采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組UU及其生物亞群與AEMAb檢測對比 不

孕組AEMAb檢測率30.00%，健康對照1.00%，兩組比較差異有統計學意義（字2=4.62，P<0.01）。不孕組UU及UU2生物亞群明顯高于對照組（字2=14.74、25.25，P<0.01），不孕組以UU2為主，對照組以UU1為主，而UU1兩組比較差異無統計學意義（字2=0.18，P>0.05）。見表1。本研究未發現兩生物亞群混合感染的標本。

2.2 不孕組患者UU及其生物亞群與AEMAb的關系 AEMAb在UU1生物亞群比較差異無統計學意義（字2=0.005，P>0.05），而AEMAb陽性者的UU及UU2生物亞群感染率均顯著增高（字2=9.79，P<0.01;字2=30.47，P<0.01）。見表2。

3 討論

影響生殖健康的病因繁多，表現復雜，其中微生物感染與免疫不孕是重要因素之一。近年來，UU檢出率不斷上升，作為一種條件致病菌，當機體內環境改變或免疫變化時，定植于宿主黏膜表面會釋放出NH3、各種磷脂酶、蛋白水解酶、過氧化物等毒性代謝產物導致機體損傷和炎癥反應[4]。本研究不孕組UU陽性率43%，對照組18%，兩者差異有顯著性，說明不孕與UU一定相關，和以往研究類似[4-5]。女性感染UU不僅引起炎癥損傷，輸卵管纖毛運動減弱甚至堵塞，還會吸附于精子表面，降低精子質量使畸形率增高，導致精子對卵子的穿透能力下降，此外UU與精子有相似抗原導致機體產生抗精子抗體，從而引致不孕發生率增高[4-5]，故有學者建議育齡婦女不孕癥要進行UU篩查及治療。

正常情況下，育齡女性周期性剝脫子宮內膜隨著月經排出體外，具有一定的免疫耐受性而不會誘導機體產生自身免疫性抗體。AEMAb是一種專門針對子宮內膜的自身特異性抗體，抗原抗體結合后激活補體，導致子宮內膜免疫病理損傷而發育不良，是影響女性不孕的重要原因之一。本研究不孕組AEMAb檢測率30.00%，健康對照1.00%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01），說明AEMAb在不孕中起重要作用。AEMAb產生后可抑制排卵、阻礙精卵結合與運送、干擾胚胎著床及影響早期胚胎的發育，導致不孕不育及早產流產的發生。AEMAb的產生除與子宮內膜異位癥、子宮內膜炎有關外，而且與流產后內膜損傷及泌尿生殖道炎癥關系密切。本研究中，女性不孕患者AEMAb陽性者的UU感染率明顯高于AEMAb陰性者，以往研究亦提示女性不孕患者AEMAb、抗精子抗體、抗透明帶抗體的產生與UU的感染有顯著關系，可以誘發女性的免疫性不孕，其可能機制為微生物感染后大量炎癥細胞聚集并吞噬受損子宮內膜，觸發抗原提呈反應[6-7]。李會平等[2]研究證明，積極治療UU生殖道感染有助阻止抗體形成，抗精子抗體及抗子宮內膜抗體轉陰率升高，使受孕機會增高。

雖然大多數研究結果認為UU與不孕不育存在一定關系，但是也有研究證明不孕組與對照組支原體感染患病率并無差異，沒必要把UU作為不孕患者的常規篩查[8]。UU在性成熟女性宮頸分離率較高，即使經過治療轉陰，經過一段時間的正常性行為又會轉陽[9]，臨床急需進一步研究如何判斷UU是感染還是攜帶狀態。作為條件致病微生物，UU致病影響因素主要有三方面：與生物亞群、血清型相關;與致病因子、UU濃度及感染時間相關;與宿主狀態有關[1]。

UU包括2個生物亞群，它的致病性與生物亞群密切相關，多數研究傾向于UU2有一定的致病力，更容易導致宮頸盆腔炎、不孕不育及早產流產，而UU1可能是優勢定植菌群而無明顯致病性[1，9]。梁旭東等[11]研究發現，UU2在異位妊娠中檢出率顯著高于對照組，組織形態學表現為更易導致輸卵管纖毛粘附、倒伏、減少甚至脫落的病變。辛亞維等[12]研究結果發現，不孕患者中UU2生物亞群檢出比率高于正常女性，而UU1檢出率組間比較差異無統計學意義（P>0.05），這可能與UU2促單核細胞分泌巨噬細胞移動抑制因子（MIF）的能力高于UU1，MIF的增加使機體產生炎癥和組織損傷。錢迎芬[13]研究亦發現，UU2具有毒性作用，UU1不具備毒性作用，引發炎癥是兩個亞群比例失調所致。本研究發現不孕組以UU2為主，對照組UU1為主，而UU1兩組比較差異無統計學意義（P>0.05）;不孕組UU2感染致AEMAb陽性者更高（P<0.01），但UU1差異無統計學意義（P>0.05），所以UU2更易導致不孕，更容易誘發機體產生免疫抗體，支持上述觀點。Kwak等[14]研究發現，性工作者UU2所占比例為正常女性的5倍，更容易出現生殖系統炎癥，而在正常女性UU2所占比例較小而不會出現病理特征，可能原因之一為UU2的致病因子或致病島對宿主破壞性更大，致病性更強。筆者早期研究也發現，男女不孕不育患者UU2與抗精子抗體關系更密切[15-16]，更容易導致不孕不育，因此臨床分群對診療甚為必要。治療方面，多西環素對UU兩大生物群敏感性均較高，UU2較UU1有更高的耐藥性[17]。然而學術界亦有不同聲音，有研究表明UU不同生物亞群、血清型與致病性并不存在特殊的相關性及區別，這可能與樣本、取材部位、地域、實驗方法、人群、種族差異有關，UU生物群致病性的多因素性和復雜性值得今后進一步探討研究[18-20]。

綜上所述，UU1生物亞群可能是定植優勢菌群，而UU2生物亞群則更易導致機體產生AEMAb引起不育。臨床開展UU分型分群，不但可以有的放矢進行臨床診治，而且對保障生殖健康具有重要意義。

參考文獻

[1]黃珺，張鈞，宋鐵軍，等.解脲支原體的致病性研究進展[J].浙江大學學報（醫學版），2013，42（4）：464-468.

[2]李會平，霍新年.不孕不育夫婦生殖道解脲支原體、沙眼衣原體感染及抗精子抗體、抗子宮內膜抗體關系探討[J].中國優生與遺傳雜志，2014，22（1）：108-109.

[3]陸春，葉庭路，馬寒，等.女性下生殖道解脲脲原體生物群與臨床癥狀相關性初步探討[J].中國皮膚性病學雜志，2009，23（10）：645-651.

[4]游燕，王夢花，戴瓊燕.生殖道支原體屬及衣原體屬感染與不孕的相關性[J].中華醫院感染學雜志，2013，23（22）：5620-5621，5626.

[5]陸小建.血清中EmAb、AsAb、UU及CT水平與女性不孕的關系[J].中國優生與遺傳雜志，2014，22（12）：75，114-115.

[6]黃新可，張羨，羅新，等.女性下生殖道沙眼衣原體及解脲支原體感染與輸卵管妊娠的相關性[J].中國實用婦科與產科雜志，2012，28（8）：628-630.

[7]蔡智慧，梁義娟，李瑞，等.女性不孕癥患者血清及宮頸黏液中自身抗體檢測對病情的評估價值[J].中國現代醫學雜志，2016，26（22）：38-41.

[8]陳曦，劉朝暉.生殖道感染與不孕不育關系的研究進展[J].中國婦產科臨床雜志，2016，17（6）：565-567.

[9]王鵬，王群興，向希映，等.解脲脲支原體耐藥性分析及生物分群研究[J].中華醫院感染學雜志，2013，23（20）：4871-4873.

[10]孟慧娟，史同新，徐敬星，等.健康成年男性泌尿生殖道解脲脲原體及人型支原體的定植狀況調查[J].中國皮膚性病學雜志，2013，27（7）：698-700.

[11]梁旭東，顧亭亭，王建六，等.不同生物亞群解脲脲原體感染與異位妊娠相關性的研究[J].中華婦產科雜志，2007，42（6）：370-373.

[12]辛亞維，張步美，王健梅，等.女性不孕患者宮頸解脲支原體亞群檢出情況的研究[J].生殖與避孕，2016，36（9）：726-730.

[13]錢迎芬.女性生殖道解脲支原體感染狀況及其分群價值的研究[J].中國實驗診斷學，2016，20（10）：1706-1708.

[14] Kwak D W，Hwang H S，Kwon J Y，et al.Co-infection with vaginal Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis increases adverse pregnancy outcomes in patients with preterm labor or preterm premature rupture of membranes[J].J Matern Feta Neonatal Med，2014，27（4）：333

[15]梅艷娟，曾文軍，鄧珍良，等.女性不孕與解脲脲原體生物亞群及抗精子抗體的相關性[J].中國熱帶醫學，2011，11（11）：75，1390-1391，1407.

[16]曾文軍，陳群，皮紅泉，等.解脲脲原體生物亞群及抗精子抗體及男性不育的相關性探討[J].山東醫藥，2011，51（7）：80-82.

[17]張艷，華川，李蘇利，等.解脲脲原體生物群分布與耐藥性差異研究[J].中國人獸共患病學報，2016，32（1）：45-50.

[18] Xiao L，Paralanov V，Glass J I，et al.Extensive horizontal gene transfer in ureaplasmas from humans questions the utility of serotyping for diagnostic purposes[J].J Clin Microbiol，201149（8）：2818-2826.

[19]武文娟，范愛萍，韓姹，等.Uu及其亞群、Mg感染與BV的相關性研究[J].現代婦產科進展，2015，24（2）：105-108.

[20]龔偉明，莫小輝，陸海空，等.運用PCR擴增技術檢測解脲脲支原體生物群的臨床應用[J].現代生物醫學進展，2015，15（10）：1848-1850.

（收稿日期：2018-05-18） （本文編輯：周亞杰）